​创制「动脉粥样硬化模型」的方法

动脉粥样硬化（arteriosclerosis，AS）是血管病中常见的最重要的一种，严重影响人类健康，是导致人类死亡的“头号杀手”。它主要影响身体内的大中动脉，如冠状动脉、颈动脉、脑动脉和肾动脉等。脂质代谢障碍为动脉粥样硬化的病变基础，常伴有高血压、高胆固醇血脂或糖尿病等。

健康的动脉具有弹性，但随着时间的推移，动脉壁会变硬，这种情况通常称为动脉硬化。受累动脉的病变内膜局部会有脂质积聚、纤维组织增生和钙质沉着，形成斑块。由于在动脉内膜积聚的脂质外观呈黄色粥样，因此称为动脉粥样硬化。

动脉粥样硬化动物模型构建的方法

一般来说，动脉硬化容易实现，而是否有斑块、斑块是什么样子，斑块的成分如何，斑块发生的部位在哪里，这些往往与人类的动脉粥样硬化斑块有很大的差别，因此，应当特别注意动物的选择。

目前可以作为动脉粥样硬化（AS）模型的动物有：兔、猪、鼠、鸡、鸽、猴和犬等。其中兔和鼠是其中最常用的，两者各有优缺点：

兔对高脂饮食特别敏感易造模，是最早用于研究动脉粥样硬化的实验动物。然而其AS病变与人的病变只在表面上相似，病变中的脂类和巨噬细胞含量远比人类大；

鼠具有抗AS性，但作为实验动物，具有经济效益高、生存能力强、死亡率低的特点，鼠AS模型病变的形态、斑块的破裂位置与人类十分相似，但鼠模型的斑块破裂处缺乏纤维蛋白和血栓形成。

01 高脂、高胆固醇饲料诱导法

高脂饲喂法早在20世纪70年代已被采用，至今仍是模拟AS模型最重要的方法。特点是死亡率低，可长期观察，但费时久。

造模机制：动物机体脂质代谢紊乱，血脂升高，容易引起血管内皮损伤，导致血管内皮功能紊乱、通透性增高，最终导致血管壁的脂质浸润、形成动脉粥样硬化。

造模方法：在动物饲料中加入过量的胆固醇和脂肪。（在基础饲料前提下，添加胆固醇、蛋黄、猪油。根据不同实验目的，采用不同配方。）

通常在一定范围内，饲料中胆固醇含量愈高，血浆中胆固醇含量升高亦愈明显，AS病变发生也愈快。但血浆中胆固醇水平与AS的形成和病变程度并非正相关，过高的血浆胆固醇水平常引起动物中毒甚至死亡。

由于啮齿类动物(如小鼠、大鼠）对胆固醇几乎不反应，为了促进病变的形成，在高脂、高胆固醇饲料中可加入胆酸盐、甲基硫氧嘧啶、丙基硫氧嘧啶、甲亢平、苯丙胺、维生素D、烟碱或蔗糖等，可进一步加速动脉病变的形成。

举例：

①兔：选用4月龄左右雄性日本大耳白家兔或新西兰家兔，给予含0.3%胆固醇饮食（建议饮食中胆固醇水平小于0.6%)，可使家兔血浆胆固醇迅速升高，6周后家兔主动脉弓可出现明显动脉粥样硬化斑块。随着饲喂时间延长，可诱导家兔胸主动脉、腹主动脉、冠状动脉出现粥样硬化斑块。

②大鼠：含胆酸和硫脲嘧啶的高脂、高胆固醇饮食诱导大鼠产生高脂血症及动脉粥样硬化。此外，给大鼠饲喂高胆固醇饮食，同时给予大量维生素D2能使血浆胆固醇水平升高，主动脉和冠状动脉出现粥样斑块。

③小鼠：选用6~8周C57BL/6小鼠，用含胆固醇1.25%、胆酸0.5%和脂肪15%的饮食饲喂10周，能诱导出动脉粥样硬化早期病变。

优点：操作简单，成本较低，较符合人类饮食的特点，病理改变与人早期相似。

缺点：造模时间较长，不易形成类似人体的后期粥样斑块病变，期间易导致继发感染从而影响实验的稳定性。

适用于：早期动脉粥样硬化的研究

造模失败的常见原因：

(1) 饲料配制发生错误或者伴有营养不良。一般是由于饲料配制不科学。

(2) 时间过短。动脉粥样硬化需要一段时、间才出现，时间过短时病理改变还没有进展到粥样硬化的地方。

02 免疫损伤法

AS的发病机制有免疫因素的存在，所以可以从免疫学的角度来建立AS模型，如使用牛血清白蛋白、卵清白蛋白、肺炎衣原体、EB病毒、巨细胞病毒、幽门螺杆菌、内毒素等进行免疫刺激，从而诱发AS的产生。

造模机制：免疫刺激引起动脉粥样硬化斑块形成及sCD40L水平升高，从而引起动脉粥样硬化。

（1）将大鼠主动脉匀浆给兔注射，可引起血胆固醇、β-脂蛋白及甘油三脂升高。

（2）给兔注射马血清10ml/kg/次，共4次，每次间隔17天，动脉内膜损伤率为88%，冠状动脉亦有粥样硬化的病变；同时给予高胆固醇饲料，病变更加明显。

（3）兔喂饲含1%胆固醇的饮料，静脉注射牛血清白蛋白250mg/kg，可加速高胆固醇饲料引起的动脉内膜病变形成。

优点：建模时间短、成活率高、模型稳定、可控性好。

缺点：所形成的单纯免疫性炎性不能涵盖动脉粥样硬化炎性反应过程，其病理特征也有待进一步观察。

适用于：动脉粥样硬化发病机制的研究

03 血管内皮损伤法

造模机制：通过外力损伤血管内皮细胞，使血管内皮通透性、黏附性、血液凝固改变，造成动脉内膜损伤或功能障碍，再辅助性饲喂高脂、高胆固醇饮食，可诱导动脉粥样硬化形成。

根据不同的外力，血管内皮损伤法可以分为机械损伤法和物理生化因子损伤法。前者主要是用球囊导管、钢丝套圈或金属丝等来损伤血管内皮，而后者则是用化学药品、电刺激、空气干燥或放射线等来损伤血管内皮。

其中球囊损伤法具有可靠性强、可重复性高、更符合临床动脉粥样硬化疾病的发生发展过程等优点。

▶ 球囊损伤法

方法：将球囊导管插入血管后，将球囊充气，反复进出牵拉3次，以损伤血管内膜。

大鼠：将充满生理盐水的塑料球囊导管自颈外动脉进入胸主动脉，向外拉至颈外动脉再进入胸主动脉，反复3次，再喂以高脂、高胆固醇饮食8周后，可以出现明显动脉粥样硬化病变。

注意：球囊损伤管到达颈总动脉中段后，进行反复牵拉时，用力一定要轻，以防动物意外死亡。

优点：时间短，定位明确，易于评价，并可根据不同的研究目的和动物，选用不同的动脉造模。

缺点：形成的斑块较易脱落而形成血栓，若球囊大小控制不佳会导致动脉破裂或建模失败。

适用于：动脉粥样硬化的用药或转基因治疗实验的研究

▶ 气体干燥法

方法：空气干燥法是以流量为50-250ml/min的干燥清洁气流吹实验部位的动脉血管内膜5-15min，以造成内膜内皮细胞变性和功能减退，建立动脉粥样硬化模型。

优点：成模时间短，操作柔和，内膜变化更接近自然状态下动脉粥样硬化形成的进程，可控性强，不易损害到血管的其他部位。

缺点：气流吹的部位要相对恒定，不宜过长，时间也要充足，若内皮损伤轻则不能形成动脉粥样硬化。

适用于：动脉粥样硬化内皮细胞作用的研究

04 动脉结扎法

方法：对血管结扎缝合使血管内血流速度和切应力发生改变，建立动脉粥样硬化模型。

优点：对内膜损害小且能保留血管弹性变形的能力。

缺点：需精良的设备，手术操作技术难度大、要求高。

05 基因改造法：

由于鼠具有抗AS性，各种基因敲除和转基因小鼠是近年来的研究热点之一。脂蛋白 E（ApoE）或低密度脂蛋白受体（LDL-R）基因敲除鼠可自发形成动脉粥样硬化斑块，是动脉粥样硬化研究的常用模型。

优点：能自发产生动脉粥样硬化。

缺点：基因改造小鼠体积小，临床性检查评估很难，与人类脂类代谢差异较大，存在一定的局限性。

适用于：动脉粥样硬化炎症和免疫因子的作用机制研究

06 联合法

高脂喂养造成的动物高脂血症是引起动脉粥样硬化的基础。而各种方法导致内膜损伤，加快了动脉粥样硬化的形成，从而节省造模所需要点时间。

如：

静脉注射脂多糖联合高脂饲料喂养法：通过兔耳缘静脉注射不同剂量(100、200、1000、2000 ng/ kg)的高纯级脂多糖引起发热性炎症反应,同时联合高脂饲料喂养建立兔 AS 模型。

腹腔注射维生素D3联合高脂饲料联合喂养法：对Wistar大鼠饲以高脂饲料基础上给予腹腔注射维生素D3，4周后，其血清Ca2+、三酰甘油及低密度脂蛋白C明显升高，动脉内膜下可见明显的钙化，出现典型动脉粥样硬化病理变化。

模型的评价指标

(1) 血清生化指标检测：如总胆固醇（TC）含量、甘油三酯（TG）含量、高密度脂蛋白（HDL）含量、低密度脂蛋白（LDL）含量、丙二醛（MDA）含量和氧化高密度脂蛋白(OX-HDL)含量等

(2) 病理形态学指标

病理学检测是“金指标”，是评价As病变重要的特异性指标

①肉眼大体观察动脉管壁进行病变硬化分级：

0级：内膜比较光滑，无奶油样变化；

0.5级：内膜有广泛奶油样变化，但无凸出于表面的斑块；

1级：有明显的凸起奶油样斑块，面积小于3mm²；

2级：斑块面积大于3mm²；

3级：斑块融合成片，大部分斑块面积大于3mm²；

4级：斑块几乎覆盖整个动脉内膜。

②主动脉弓油红O染色

③主动脉HE染色

模型组的内皮下层增厚，有一些较均匀分布的小斑块（着色浅）,内膜细胞排列比较紊乱。

④电镜观察

正常血管内皮不吸附白细胞，但是高胆固醇饮食的动物模型，早期血管内皮表面就能吸附多种白细胞的黏附分子。

结语

不同的动物种属、饲料配比差异、饲养周期等均会影响造模的成功，所以一定要做好预实验，充分查文献，确定病变过程和相应的时间窗。（时间过短，血管内皮无斑块；时间过长，错过时间窗就尴尬了。）