Mol Cancer | circACTN4与FUBP1互作调节原癌基因MYC的表达促进乳腺癌的发生和进展
文章名称：The circACTN4 interacts with FUBP1 to promote tumorigenesis and progression of breast cancer by regulating the expression of proto-oncogene MYC
发表期刊：Molecular Cancer
影响因子：27.401
发表时间：2021年
合作单位：重庆医科大学
样品类型：Cancer and para-cancer tissues of 80 breast cancer patients，normal breast epithelial MCF-10A cells， breast cancer MCF-7，SK-BR-3 cells，293 T cells，breast cancer ZR-75-1, BT-474，T-47D cells，Four-week-old female BALB/c nude mice。
运用技术：CireRNA，RT-PCR，FISH，免疫荧光，原位杂交，双荧光素酶报告基因，细胞增殖，细胞迁移，细胞清晰，细胞周期，细胞凋亡，ChIP，RNA-Pulldown，RIP，CoIP，免疫组化，WB。
研究背景
乳腺癌是全球女性发病率最高的恶性肿瘤之一。2018年全球新诊断乳腺癌约210万例，约占所有女性恶性肿瘤病例的25%，是全世界女性癌症死亡的主要原因。因此，迫切需要为乳腺癌寻找新的治疗靶点和策略。
circRNAs揭示了不同病理情况下的疾病特异性和发展阶段特异性特征，失调的circRNA参与了各种癌症的发展，circRNAs可以与RNA结合蛋白（RBPs）相互作用，发挥生物学功能，然而，乳腺癌中circRNA与蛋白质之间的相互作用和关系在很大程度上仍然未知。
FUSE结合蛋白1(FUBP1)是一种多功能DNA和RNA结合蛋白，与转录、翻译和RNA剪接细胞过程有关。众所周知，FUBP1可以与c-MYC启动子上游的FUSE结合，募集并激活转录因子TFIIH，从而促进c-myc基因的转录。FUBP1也可能与FBP相互作用阻遏物(FIR)结合，与FUSE和TFIIH形成抑制复合物，并抑制c-MYC转录。FUSE、FUBP1和FIR在这种分子机制中的相互作用可以实时微调c-myc转录。在许多癌症中发现了FUBP1过表达，并导致包括MYC癌基因在内的靶标失调，迄今为止，尚未探索circRNA与FUBP1之间的关联。
重要结果
1. circACTN4的鉴定
作者通过微阵列分析筛选出高表达的环状RNA hsa_circ_0050900 (circACTN4),荧光原位杂交以及核质分离实验检测其主要定位于细胞核。相对于线性基因，circACTN4更加耐受放线菌素D和RNA酶 R消化。随后通过生物信息学预测、双荧光素酶报告基因和染色质免疫沉淀(ChIP)实验证明转录因子USF2与ACTN4的启动子区域结合，促进ACTN4转录。构建USF2的过表达和干扰质粒，证明USF2可以促进线性ACTN4以及circACTN4的表达。
图1 circACTN4在乳腺癌中的验证和鉴定
2. circACTN4的表达与临床病理分期的关系
qRT-PCR结果显示circACTN4在乳腺癌组织中显著高表达；ROC曲线显示circACTN4的表达可以作为乳腺癌的诊断指标；此外，circACTN4在乳腺癌细胞(MCF-7、SK-BR-3)中显著高表达；作者又利用乳腺癌组织芯片(TMAs)来测定ISH对circACTN4的表达，结果显示circACTN4高表达的患者总生存期更短。且circACTN4的表达与T期、N期、TNM期正相关。
图2 circACTN4在BC中表达上调，与BC患者病情进展及预后不良相关
3. circACTN4可促进BC细胞增殖，调节BC细胞凋亡
作者构建circACTN4的过表达载体和小干扰质粒，通过qRT-PCR进行转染效率验证。随后通过平板克隆、EdU以及CCK-8等功能实验验证circACTN4可以促进乳腺癌细胞增殖。Hoechst 33342染色、流式细胞术以及western blot等实验验证敲低circACTN4可以促进乳腺癌细胞凋亡。
图3 circACTN4可促进BC细胞增殖，抑制BC细胞凋亡
4. circACTN4促进细胞的迁移和侵袭，并调节细胞周期进程
细胞划痕、小室侵袭和迁移等一系列实验结果显示circACTN4可以促进细胞的侵袭和迁移。随后作者用western blot检测转移相关蛋白nm23-H1、MMP9、MMP2蛋白水平，结果显示MMP9、MMP2蛋白水平与circACTN4表达呈正相关，而BC细胞中过表达circACTN4后，nm23-H1蛋白水平下调。流式细胞术和western blot实验检测结果表明敲低circACTN4可以调节乳腺癌细胞周期的进程。
图4 circACTN4促进BC细胞的迁移、侵袭和细胞周期进程
5. circACTN4与FUBP1相互作用，激活MYC转录
为了探索circACTN4的分子机制，作者通过pull down联合质谱分析以及RIP实验验证circACTN4与FUBP1相互结合，且circACTN4和FUBP1在细胞核中共定位。作者发现circACTN4的水平变化并没有改变FUBP1的表达水平，表明circACTN4没有参与FUBP1的翻译后调控。qRT-PCR、western blot和 Pearson相关分析结果证明FUBP1明显促进MYC在乳腺癌细胞表达水平且FUBP1在乳腺癌组织的表达明显高于邻近的正常组织，并且circACTN4的水平与BC组织中FUBP1的表达呈正相关，MYC在BC组织中高度表达且与FUBP1的表达呈正相关，circACTN4与 MYC在乳腺癌中的表达正相关，circACTN4可以促进MYC和其下游蛋白CDK4 ,CCND2的表达。
图5 circACTN4可以与FUBP1结合，上调MYC的表达
6. circACTN4和FIR竞争结合FUBP1
为了验证circACTN4和FIR是竞争关系的假设，通过qRT-PCR检测结果表明FIR的表达在乳腺癌中明显下调。Pearson相关分析显示，在BC组织中FIR的表达与circACTN4、FUBP1、MYC水平呈负相关。随后，作者通过Co-IP和一系列ChIP实验验证了circACTN4与FIR是竞争性结合FUBP1的。此外，作者通过qRT-PCR和western blot结果发现，FIR的水平与MYC的水平相反。最后，作者通过共转染后的qRT-PCR结果发现，过表达FIR可以逆转circACTN4对MYC表达的增强作用，而敲低FIR可以抵消circACTN4下调对MYC表达的抑制作用。
图6 circACTN4阻断FUBP1与FIR的结合
7. FIR逆转circACTN4在BC细胞中的促肿瘤作用
作者通过质粒共转染进行一系列的挽救实验，验证circACTN4是否通过circACTN4/FUBP1/MYC轴发挥生物学作用，结果表明，FIR过表达可显著逆转circACTN4上调对BC细胞增殖、迁移和侵袭的促进作用。此外，IF实验也显示过表达和敲除FIR可以明显逆转circACTN4上调和下调对MYC表达的影响。western blot分析显示，FIR可以逆转circACTN4对MYC及其下游蛋白CDK4和CCND2表达的促进作用。
图7 FIR逆转circACTN4在BC细胞中的促肿瘤作用
8. circACTN4促进体内异种移植瘤的发生和转移
进行一系列体内实验，结果显示过表达circACTN4组移植瘤的体积和重量明显大于对照组。此外，与对照组相比，circACTN4上调明显增加了转移性肺结节的数量，且circACTN4可显著促进肿瘤血管生成。western blot结果显示，过表达或沉默circACTN4组移植瘤组织中MYC蛋白水平显著升高或降低。生物发光结果显示circACTN4过表达增强了乳腺癌细胞在裸鼠体内的增殖和转移。此外过表达circACTN4组小鼠总生存率更低，肝转移更广泛。最后，我们通过免疫组化的方法确定了circACTN4促进靶蛋白MYC、下游细胞周期相关蛋白CDK4和CCND2以及细胞增殖相关蛋白Ki67的表达。
图8 FIR逆转circACTN4在BC细胞中的促肿瘤作用
原文总结
发现了在人类乳腺癌组织和细胞中上调的新型环状RNAcircACTN4，circACTN4表达增加与乳腺癌患者的不良预后相关，并证明了circACTN4的过表达可以有效地增加乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移。USF2介导的circACTN4可直接与FUBP1结合，它们的相互作用会阻碍FUBP1与FIR的结合，从而激活MYC的转录并促进乳腺癌的发育。研究结果表明，circACTN4可能是一种新的预后生物标志物和有前景的乳腺癌治疗靶点。
