干细胞分离、表面标志物流式鉴定及增殖能力和分化能力（成骨诱导，成脂诱导等）检测
作为生命的种子，干细胞在生物界叱咤风云已久，是目前公认的明日之星。从“多利”绵羊的诞生，到诱导性多能干细胞（iPSC）的发现。再到现如今，无论是疾病模型，细胞治疗还是器官移植再生医学方面的突飞猛进，都让我们始终相信干细胞治疗的愿景终将实现。
当然，突飞猛进的现况，离不开干细胞基础和临床研究这些星星之火。干细胞的分离和鉴定，则是众多干细胞基础研究和临床研究的基础和根本，也是研究结果可信度判定关键核心步骤之一。干细胞的特征是多向分化能力以及多代增殖能力，其鉴定主要依据其在形态特征、细胞成分与结构、基因修饰与表达差异、生长特性、表型标志、体内外分化潜能等方面与成熟细胞的差异，从概念上讲，干细胞的最基本特征是自我更新能力和多向分化潜能，增殖能力是考察干细胞活性的重要依据，而在体内外是否能够向多种类型的成熟细胞分化则是认定干细胞的“金标准”。
干细胞的鉴定主要从形态学和功能学两方面来进行。形态学方面的鉴定包括表面形态、表面标记分析—流式鉴定（FACS）、免疫组化等。功能学方面的鉴定主要包括增殖能力（自我更新能力）和分化能力（成骨诱导分化，成脂诱导分化，成软骨诱导分化）等鉴定。
干细胞鉴定步骤
1、准备细胞：取培养的细胞离心(300g/5min)弃去上清，以Buffer溶液重悬，注意观察细胞的分散程度，是否有团块，若有团块，需静置3-5分钟，弃去团块，并再次静置3-5分钟，继续观察细胞分散程度，若仍有团块，则重复上面步骤，加入一定量PBS洗涤一次，弃去上清。
2、弹散细胞，计算需要检测的细胞量，并用细胞计数仪对细胞悬液进行计数，稀释到所需的细胞数，细胞重悬到5*106 ~10*10⁶ /ml之间；
3、取100 μl的细胞于EP管或流式管内，按量加入抗体，加入抗体时必须和细胞保持充分的混合，可在震荡仪上稍微混匀。在4℃冰箱孵育30分钟。
4. 每样品管加入1.5~2ml Buffer溶液，重悬细胞，250g离心4min后弃去上清。
5. 重复洗涤一次，吸去上清液。于每个样品管内各加入100ul Buffer溶液，重悬细胞。
6. 按量于各个样品管内加入相对应的二抗，加入抗体时必须和细胞保持充分的混合，可在震荡仪上混匀（避光）。
7. 室温或4℃避光孵育30min。
8. 于每样品管内添加适量（1.5~2ml）Buffer溶液，用最大量程为1ml的移液枪小心吹打混匀。
9. 离心（244g，4min），吸去上清液。
10. 于每样品管加入400μl Buffer溶液，重悬细胞，用滤网过滤细胞，上机检测。
检测指标
1、肿瘤干细胞
肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells, CSCs)，也被称为肿瘤启动细胞（tumor initiating cell ,TICs），被认为是肿瘤组织内有自我更新、高致瘤性, 分化潜能等特征的一个小细胞亚群（1%-5%），是维持肿瘤生长的核心，通过与肿瘤微环境相互作用，CSCs可维持自身的可塑性，同时促进肿瘤发生、发展、侵袭、转移等过程。
肿瘤干细胞靶向治疗及研究的前提条件是CSCs鉴定及有效的分离，CSC的鉴定包括以下几种方式：
（1）体内致瘤实验，将CSC接种于免疫缺陷动物, 经过一段时间培养, 观察免疫缺陷动物肿瘤生长情况.；其中异体移植实验被认为是鉴定CSC的金标准；
（2）体外克隆实验；普通肿瘤细胞在有限次传代后便会死亡；CSC因其有极强的自我更新及无限增殖功能, 能连续传代；
（3）传代培养，CSC有多向分化能力, 在体外培养时, CSC向普通肿瘤细胞分化, 最终失去分化能力;
（4）ALDH1、Hoechst33342染料法等；
（5）根据表面标志物进行流式鉴定及分选。
表一：不同肿瘤中的CSCs的表面标志物
1. 肿瘤标志物的选择：肿瘤发展到不同时期，表面标志物表达水平在不同微环境中, 由于各种生长因子的影响, 或是其他影响因素可致其发生动态变化；而已分选出的CSC在体外培养条件下也可能发生显著的表型变化；
2. 一种类型的CSC标志物不能用于鉴定其他类型的CSC；
3. 有些表面标志物对酶消化敏感，而实体肿瘤的CSCs鉴定及分离必须经过酶消化；可以使用Ca2+螯合的EDTA替代胰酶消化。此外，有文章中作者提到其实验室在清洗步骤时使用了预冷不含Ca2+的PBS作为清洗液，接着使用含有2mM EDTA的PBS孵育并在全培养基中用枪吹打解离，这些尝试对于解离哺乳动物细胞系是比较有效的[9]；
4. EDTA长时间孵育会导致细胞聚集，对于不同的细胞系其解离时的孵育时间需要分别优化；
2、多能干细胞
3、人间充质干细胞
间充质干细胞在基础研究和临床细胞治疗领域都有广泛的应用，其组织来源以及分离、培养方法多种多样，为规范化MSC相关研究，国际细胞治疗协会，即ISCT（International Society for Cellular Therapy）规定了人MSCs培养后的鉴定标准：
1、正常培养条件下贴壁生长；
2、表达CD73，CD90，CD105抗原，不表达CD45，CD34，CD14或CD11b，CD19，HLA-DR；
3、体外培养定向诱导后能分化为脂肪细胞，软骨细胞以及成骨细胞。
4、神经干细胞（NSCs）
神经干细胞具有分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的能力，能进行自我更新并分化形成新的脑组织细胞。作为最特殊一种干细胞，NSCs的研究已成为近年来脑科学研究的一个重要方向，也是目前生命科学研究的热点，如何正确鉴定各种神经细胞的表型对于培养过程和后期应用都具有十分重要的意义。
5、造血干细胞/祖细胞
造血干细胞/祖细胞的研究为深入了解造血及造血干细胞在临床治疗中的应用做出了重大贡献。美天旎为您提供用于人HSC/HPC研究的完整解决方案。所有用于人HSC/HPC研究的产品都是经过优化的，可将我们提供的标准方法直接应用于HSC细胞的分离、培养和分析这一完整的实验过程。
6、小鼠骨髓间充质干细胞
7、大鼠骨髓间充质干细胞
Tips：国际细胞治疗协会间充质和组织干细胞委员会2006年提出了MSC鉴定的最低标准，关于细胞表型的要求是表达CD90，CD105和CD73，不表达CD45，CD34，CD14或CD11b，CD79a或CD19和HLA-DR；阳性指标都需要染色，阴性指标一般选择2-3个指标，因为是做细胞表型鉴定，所以最好要配齐同型对照。
干细胞功能蛋白
干细胞筛选标志物
最后编辑于 2022-10-09 · 浏览 4283
