过表达引物设计-番外篇

经常有人问我：构建过表达载体时，引物设计往往局限于基因的起始密码子和终止密码子附近，上游引物通常是ATG往后15-25个碱基，下游引物通常是TGA/TAA/TAG往前15-25个碱基）。然而起始密码子和终止密码子附近碱基顺序设计出来的引物特异性不高或者引物结构不理想，这个问题如何解决呢？

这里给出我的常用处理方法：

1. 找公司合成片段；
2. 往CDS区外伸出设计引物；
3. 可以用巢式PCR。

第一点就不必多说，很多公司都有此项业务（0.8-1.2元一个碱基），2、3点有钱课题组绕路，避免头疼。

然而只要你构建的载体够多，那么番外篇的这些方法，很多时候你都可能会遇到、也将要用到，为了方便阐述我用过表达引物为例（它并不局限于过表达载体的设计）。

• 往CDS区外伸出设计引物

要讲过表达引物设计就必须先了解转录和翻译的原理，很多人设计基因过表达片段引物会有误区，觉得一定要从ATG开始，其实不是，启动子与起始密码子之间最好留有一定的距离才能使基因高效、准确表达，要充分理解就要从转录和翻译原理开始。

基因转录：是RNA聚合酶识别启动子，转录因子结合到启动子区域，双链DNA开始解链，RNA聚合酶将模板链转录为mRNA (从模板链的启动子之后到polyT尾转录为mRNA，不包含启动子)；

mRNA翻译：三元复合物（eIF2-GTP-Met-tRNAi^Met）与40S核糖体亚基结合形成43S起始复合物，起始复合物结合到受其它转录因子激活的mRNA上，43S核糖体亚基将沿着mRNA从5’端转录因子结合区开始，向着3’端扫描直到遇到AUG，三元复合物里的Met（甲硫氨酸）留在复合物中，三元复合物其它因子解离，60S亚基加入，形成80S延伸复合物，其它tRNA-氨基酸按照反密码子顺序进入核糖体大亚基（80S延伸复合物）中，将氨基酸组装到Met后，以此类推，直至遇到终止密码子或发卡结构。

这里可以捕捉到两个关键点：也就是翻译从43s遇到的第一个AUG开始的，AUG前面可以留有一定距离（文献说一般50-100bp左右，但我试过200bp的没问题）；第一个AUG可以是原来CDS的ATG转录过来的，也可以不是（通过自己添加等）。

下面我用homo FGF8为例做设计讲解，图为FGF8 CDS序列

如果直接用前后20bp做引物，那么结果如下，显然GC含量过高、引物参数不好，不利于PCR反应进行。

于是我们可以考虑将引物伸出到两边，具体策略：

1. 从NCBI下载完整的FGF8 mRNA序列，与上面FGF8 CDS比对，找出ATG和TAG的位置标记。
   
2. 往两侧伸出设计引物，以mRNA作为引物设计的模板，上游引物以ATG+20往上（即相反方向）寻找合适的引物。当找到数据较好的引物时，标记，并且查看其到ATG的距离，如下图，引物到ATG的距离159bp，为3的倍数。
   
3. 然后有两种方法做后续处理。第一，以原来CDS的ATG作为起始密码子，直接在引物前加酶切位点就行；第二，在引物前加ATG再加酶切位点，翻译从新加的ATG开始（因为这个新加的ATG转录成TUG后会最先遇到43S核糖体亚基），而新旧ATG之间的这段序列也翻译出来作为冗余序列，不影响原序列功能。下游的处理方法类似，在TAG处已经终止翻译，后面有多长序列也不影响（除非你后面有融合标签）。
   
4. 上下游设计完，FGF8的引物数据可以表示为
   
   这是绝对比直接在CDS区的ATG和TAG处设计引物好很多。按照两种处理方法上游的引物分别会是什么呢？这里留个思考题，我会在评论区给出答案。

• 巢式PCR方法

巢式PCR是一种变异的聚合酶链式反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似，第二对引物为巢式引物，他们在第一引物的内部，以第一次PCR产物为模板进行扩增，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。第一次PCR服务于第二次PCR，增加第二次PCR的产物量以及产物特异性。当引物位置受限且该位置引物特异性不高时，可以在此引物外部先设计另外一对特异性较高的引物进行扩增，将产物作为模板进行第二次扩增。

我们在进行过表达引物设计的时候遇到CDS区扩增引物数据不良情况下可以用巢式PCR方法。具体步骤：

1. 外引物（第一次扩增用的引物）以mRNA为设计模板，将引物设计在ATG和TAG外的mRNA区。
2. 内引物（第二次的引物）以CDS为设计模板，选取ATG及其+20bp作为前引、TAG及其-20bp设计。如果第二次引物设计的时候遇到引物参数不好的情况，参照“CDS伸出引物设计”方法适当伸出设计，但记住避免移码突变。外引物不需要加酶切位点等，只加在内引物上。引物设计方案如下图
   
   其PCR操作是：
3. 以逆转录cDNA作为模板，用外引物扩增第一次，纯化回收扩增产物（为了确定是否正确可以跑琼脂糖凝胶进行大小验证）
4. 以回收产物作为模板进行第二次扩增，之后跑琼脂糖胶验证大小，之后纯化回收、酶切、连接等构建到载体上。
   

本文做为分子引物设计的策略，文章中很多表达可能词不达意，可能要善于思考，才能融会贯通。如若不解依旧，望私，见且有识，必回！