经验分享 | PCR 初学者秘籍，带你从入门到精通！
RT-PCR 是大多数实验汪在科研道路上需要做的实验🔬
大家看到这儿一定不以为意，这不就是个简单的小实验，看两次 protocol，后面都不需要操作指南也能记住步骤的。
可是…记住了实验步骤就真的等于能做好实验？能得到想要的数据、漂亮的曲线吗？以下标准 PCR protocol 以及几点 tips 请查收：
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RT-PCR 几个重要步骤
Tips-1：你确定你的 RNA 没有降解吗？
NanoDrop 2000 只能检测 RNA 的浓度以及纯度，而对于 RNA 的完整性是没法检测的。最快速的方法就是用普通的凝胶电泳。
要求在 nuclease-free 的环境下，所以需要将电泳槽、溶胶瓶、凝胶托槽以及梳子用 DEPC 水冲洗干净。琼脂糖也是 nuclease-free（只要是新开封的就行），Loading Buffer 尽可能是新开封的，配置 1.2% 的凝胶。
注意，凝胶一定要保证溶解完全，要不然会导致条带不均一。电压太高或者跑太长时间会产热，导致 RNA 降解，所以要合理控制电压和时间。此外，跑胶也可以进一步确定样品中是否有 DNA 的残留，观测点胶孔是否有大量滞留的条带。
Tips-2：你确定你的 cDNA 的浓度吗？
实验室大师兄的经验是每次反转得到的 20 ul 体系的 cDNA 直接稀释 20X，而博后师姐是按照 10X 稀释，我一般是看情况而定。因为每个人提的 RNA 质量不同，反转的水平也分高低，再说反转的技术也未必稳定。
所以在每次拿到反转的 cDNA 后，我首先会稀释 3 倍左右，然后利用管家基因做一次 RT-PCR，循环数一般为 25 cycle，鉴定一下具体浓度，再决定最后的稀释倍数。
Tips-3：你确定你的引物好用吗？
可以通过 qRT-PCR 的溶解曲线，但是呢，这个还是要耗钱的。对于没有很多钱的实验室来说，在拿到很多引物的时候，可以通过普通的 RT-PCR 看看是否是单一条带，鉴定一下引物的特异性。如果实验室不差钱，则可以通过溶解曲线对所有的引物的特异性做一次鉴定。
Tips-4：你确定你的 PCR 板和仪器配套吗？
如果你用的是 BIO-RAD 公司的定量 PCR 仪器，那么你一定要买配套该仪器的 qRT-PCR 板。
因为不兼容的 PCR 板会导致结果偏差。因为我的师姐就真的碰到过这种情况。
Tips-5：你确定你的实验条件合适吗？
SYBR 要避免强光照射，所以在加 SYBR 试剂的时候尽量关掉头顶的照明灯，只需借助微光完成就可以。
SYBR 放置 4 ℃ 保存，使用时轻轻上下颠倒混匀即可，避免泡沫产生，切忌用力涡旋。
有些小师妹怕自己加样搞混，喜欢在 PCR 板上划出标志，这样做是不对的。因为你的标记极有可能影响到荧光信号的采集，所以一般我会建议师妹采用实验记录本协助记忆，如下所示。
图.qRT-PCR 加样图
Tips-6：你确定你的操作正确吗？
一定要戴手套，戴手套，戴手套，重要的事情说三遍。
为了减少 SYBR 在光下的曝光，个人喜欢先加入模板， 如下图。根据经验，少量模板的加入，容易造成加样误差。所以为了尽量减少加入少量模板造成的误差，我一般会将样本再稀释一倍，加样的时候多加一倍，减少 H2O2 的加入量。
图.qRT-PCR 加样示意图
然后配置 qRT-PCR 体系，如下：
图.qRT-PCR 体系配制图
注：配置过程需在冰上完成。
加好样品后，贴好透明封板膜。尽量不要用手碰透明封板膜的表面，从膜两边空余处操作就行。因为手印也有可能可能影响到荧光信号的采集。然后就是用离心机低速迅速离心 10 S，防止样本挂壁。
好了，基本的操作部分以及注意事项就这么多，希望能帮到大家😜
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好啦，今天的经验分享就到这里啦，如果你还有其他实验问题，欢迎将提问发布到丁香实验小程序上哦👍
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最后编辑于 2022-10-09 · 浏览 2340
