关于二次PCR，胶回收，乙醇沉淀的一些心得
发布于 2022-03-31 · 浏览 1793 · IP 河南河南
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本人的目的是想通过PCR得到125bp的片段，最初设计是通过巢式PCR得到，因为不顺利就想做切胶回收和二次PCR。
切胶回收:以基因组DNA为模板，扩增得到125bp片段后切胶回收时用的是生工的琼脂糖凝胶回收试剂盒，但是125bp片段太小，回收效率非常不理想，粗略估计在20%左右。因此就拿胶回收液做二次PCR后进行乙醇沉淀来得到更多的目标片段。
二次PCR：与从基因组扩增有所不同，一定要降低循环数和稀释胶回收液，二次PCR的弊端在于容易产生非特异性条带，琼脂糖凝胶看不出来，聚丙烯可以看出来
乙醇沉淀：-20℃的过程适当延长，我用的是90min,4℃离心时间30min,此外特别要注意EP管放在离心管的位置并牢记，拿出后不要随机切换角度以及随意晃动。如果下一步有酶切或者链接实验，两次乙醇洗涤后放入37℃温箱10-20min,直至乙醇完全挥发。挥发后2000r,1min短暂离心使DNA沉于管底，加TE溶解即可。我做的最成功的一次浓度可达120ng/ul,比胶回收省事且损失较小
如需要详细步骤可联系我
最后编辑于 2022-10-09 · 浏览 1793
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