用对小鼠模型，NK免疫细胞重建如此简单

自然杀伤（NK，Natural Killer）细胞是免疫系统的前线部队，约占总淋巴细胞的5-20%，可以对病毒或恶性细胞做出特定反应，它们在人体中不断巡逻，当检测到病毒感染或肿瘤细胞时，它们锁定目标并通过诱导细胞凋亡来破坏它们，同时通过释放炎症细胞因子发出危险信号，所以在癌细胞的清除和癌症治疗中，NK细胞都发挥重要作用 ^[1] 。

NK细胞的功能

NK细胞无需事先激活就能够直接杀死病毒感染的细胞和肿瘤细胞，不仅在肿瘤发生的早期阶段迅速识别并发挥对靶细胞的直接杀伤，还可以与包括树突状细胞（DC）在内的免疫细胞进行联系，以改变适应性免疫应答，从而增强CD8 + T细胞介导的抗肿瘤应答。在多种肿瘤环境中，CD8+T细胞的抗肿瘤能力需要NK细胞功能，NK细胞在其表面上表达多种激活受体，抑制受体和细胞因子（IFN-γ, TNF-α, IL-10）或趋化因子（CCL3, CCL4, CCL5, XCL1）受体，其激活和功能依赖于来自抑制受体的信号传导和激活受体之间的平衡^[2]。

NK细胞受体

阻断检查点抑制剂可促进NK细胞抗肿瘤功效，肿瘤微环境中的许多因素诱导NK细胞功能障碍，如抑制性检查点受体的上调和肿瘤浸润NK细胞上激活受体的下调所证明的那样，这可能导致NK细胞衰竭^[3]。抑制性受体（KIR）如NKG2A、TIGIT、PD-1、TIM-3、LAG-3等，激活受体如NKp46、NKp30、CD16、NKG2D、NKG2C、NKG2E等，使用单克隆抗体阻断这些免疫检查点受体将恢复NK细胞的抗肿瘤活性^[4]。与不同检查点抑制剂联合使用或检查点抑制剂与其他治疗药物联合使用可以进一步增强抗肿瘤疗效。

NK细胞治疗

目前应用于NK细胞相关的治疗方式，主要包括下面几种方式：

1、 免疫检查点抑制剂，解除NK细胞的抑制信号；

2、 激活NK细胞的活性功能；

3、 靶向肿瘤特异性靶点通过ADCC作用清除肿瘤细胞；

4、 基于CD16A和其他靶点结合双特异性抗体疗法；

5、 免疫检查点和基于CD16A功能的联合治疗；

6、 靶向肿瘤特异性抗原的细胞治疗如CAR-NK等。

NK靶点研究相关模型

目前常用的2种人源化方式，一种是同种移植肿瘤模型，使用靶点基因人源化动物模型接种鼠源细胞系，另一种是异种移植肿瘤模型，使用免疫系统人源化动物模型得到植入人免疫系统的小鼠，接种肿瘤细胞后进行给药治疗，两种动物模型各有优缺点，百奥动物开发了这2种动物模型，可以满足NK细胞相关靶点的各种需求。

同种移植肿瘤模型

我们开发了NK细胞相关靶点的小鼠和TAA靶点相关细胞系，小鼠和细胞系列表请查看最后列表，此处以NKG2A为例介绍：

NKG2家族是NK细胞上的一类重要受体，包括NKG2A，NKG2B，NKG2C，NKG2D，NKG2E，NKG2F，NKG2H等成员， 均为C型凝集素样结构。该家族的大多数成员均与CD94结合成异源二聚体进行表达，唯有NKG2D与NKG2F不与CD94结合。NKG2家族成员按功能可分为活化性受体和抑制性受体两大类，分别传递正性和负性信号，调控NK细胞的细胞毒作用和细胞因子的释放，使NK细胞在机体免疫监视和早期抗感染免疫过程中发挥重要作用。

NKG2A在活化的CD8+T细胞和NK细胞中表达，大约一半的外周血NK细胞表达NKG2A。目前靶向CTLA-4和PD-1/PD-L1的单克隆抗体已经取得确切疗效，但病人的应答率较低，还不能充分满足临床需求，已有研究表明NKG2A可以与PD-1、PD-L1等靶点联用产生更好的治疗效果。我们开发了NKG2A单人源化小鼠和CD94/NKG2A双人源化小鼠，成为验证CD94/NKG2A靶点药物的有力工具。

A：B-hCD94/hNKG2A小鼠脾脏白细胞亚群分析，引入hCD94/hNKG2A代替其小鼠对应物不会改变这些细胞类型在脾脏中的整体发育、分化或分布。B：抗人NKG2A抗体（monalizumab, in house）可有效控制B-hCD94/hNKG2A小鼠的肿瘤生长，证明其为抗人NKG2A抗体的体内评价提供了有力的临床前模型。

异种移植肿瘤模型

基于NK细胞免疫重建的小鼠模型及应用

我们已成功利用B-NDG小鼠建立造血干细胞（CD34+HSC）免疫系统重建，但人类免疫细胞和小鼠组织或细胞之间的物种屏障限制了这种免疫系统人源化小鼠的部分免疫功能，例如NK 细胞的重建比例无法达到人体生理水平，这限制了B-NDG小鼠在临床和药物筛选上更广泛的应用，为解决这一问题，获得具有促进人T细胞和NK细胞正常发育的动物模型,我们在B-NDG小鼠基础上开发了B-NDG hIL15 小鼠，使其表达人 IL15 细胞因子，同时从人PBMC中纯化NK细胞后进行重建，将成为研究人NK 细胞发育和功能有效的动物模型。

从PBMC中纯化NK细胞进行人NK细胞免疫重建

B-NDG hIL15小鼠NK细胞重建后CD56+细胞的分析。利用分选试剂盒从人PBMC中纯化NK细胞，将分选后的NK细胞(2E6)静脉注射到纯合子B-NDG hIL15(雌性，6周龄，n=8)和B-NDG小鼠(雌性，6周龄，n=8)中。流式细胞术分析移植人NK细胞后的小鼠外周NK细胞的数量和比例。与B-NDG相比，B-NDG hIL15显示更高的人NK细胞百分比，并且在注射后6周仍然维持高水平重建。结果表明，人NK细胞在重建后的B-NDG hIL15小鼠中重建成功。

NK细胞重建后的NK细胞功能检测

人NK细胞重建后的B-NDG hIL15小鼠中，功能性NK细胞标记物如Granzyme B、NKG2A、NKG2D、NKp46等数量显著增加，证明NK细胞具有杀伤功能，其他功能性NK标记物如perforin、CD107、NKp30、CD57等也有类似趋势(数据未在此显示)。

抗人Claudin18.2在人NK细胞免疫重建模型中的药效验证

从PBMC中纯化的人NK细胞(2E6)静脉注入纯合子B-NDG hIL15小鼠。A549-hClaudin18.2(1E7)植入B-NDG hIL15小鼠体内。当肿瘤体积达到约100-150mm3时，小鼠被分组(n=6)，用抗人Claudin18.2抗体治疗。结果表明：Claudin18.2抗体（IMAB362,内部合成）对人NK免疫系统重建模型B-NDG hIL15小鼠有抑制肿瘤生长的作用。

抗人Claudin18.2抗体对基于NK细胞重建的B-NDG hIL15小鼠的抗肿瘤活性

在药效试验中，对移植人NK细胞后的B-NDG hIL15小鼠的人免疫细胞进行分析。观察血液中人免疫细胞比例的变化，发现给药组人CD45、CD56、CD16的比例高于对照组，这表明NK细胞在实验期间也维持了高水平。

百奥动物可以提供同源肿瘤模型和异源肿瘤模型相关药效评价模型和药效服务，如有需要可参考下图或联系对应BD。

参考文献

[1] Perera Molligoda Arachchige, A.S. Human NK cells: From development to effector functions. Innate Immun 27, 212-229 (2021).

[2] Crinier, A., Narni-Mancinelli, E., Ugolini, S. & Vivier, E. SnapShot: Natural Killer Cells. Cell 180 (2020).

[3] Morvan, M.G. & Lanier, L.L. NK cells and cancer: you can teach innate cells new tricks. Nat Rev Cancer 16 (2016).

[4] Zhang, C. & Liu, Y. Targeting NK Cell Checkpoint Receptors or Molecules for Cancer Immunotherapy. Frontiers in immunology 11, 1295 (2020).

百奥动物

立足全球生物医药行业，从技术创新出发，百奥赛图建立“BioMice百奥动物”子品牌。百奥动物集创新动物模型研发制备、生产供应和实验服务为一体，拥有2500余个独特基因编辑动物/细胞系模型，覆盖肿瘤，自免，代谢等多个疾病领域，包括重度免疫缺陷B-NDG及系列小鼠、靶点人源化小鼠和全人抗体RenMice三大系列产品，结合优质的药理药效评价服务，以高标准的3大动物中心为支撑，极大的满足了全球科学研究和药物开发需求。创新的动物模型、高标准的质量管理、多元化的服务平台，助推生物医药创新产业的快速发展。