RT-QPCR的新手实践经验总结，请各位大佬指点

作为一名研一的研究生，除了上学期的上课，下学期必不可少的需要学习很多的实验操作。因为课题组师兄师姐都没做过Q PCR实验，所以研一的我成为了课题组的第一人。（因为是帮师兄做的实验，整个过程没少被师兄吐槽）

一 实验前的准备

因为整个qpcr实验需要尽量避免RNA酶的干扰，而RNA酶在环境中又无处不在，所以我们在实验前需要将要用到的耗材进行处理。塑料制品（枪头，ep管）我们使用depc水浸泡过夜，烤干备用。实验前一晚，将泡过depc水的枪头，ep管和镊子（不用泡depc）等高压灭菌，放入烘箱备用。将研磨珠和离心管放入冰箱预冷（研磨用）。配置75%的乙醇，准备异丙醇，放入冰箱备用。

二 提取RNA

这次实验用的是组织（脑），所以在用试剂盒提取之前需要先将组织研磨，我们的组织是当时取好的，放在-80℃中存放的。组织先称重，估算一下后续提取试剂的量，试剂盒上几乎都写着使用液氮研磨，但我们是用研磨仪研磨，我们用的珠子是这样的。

① 每25mg组织加入了500ul的提取试剂（特殊2ml离心管），放入研磨珠，60hz，8s研磨。下列操作全程置于冰上操作。向裂解液中加入200ul的DEPC水，上下颠倒，室温静置5min。12000g室温离心15min。

② 吸取上层水相550ul于新的离心管（1.5ml）中，加入550ul异丙醇，上下颠倒混匀，静置10min。12000g室温离心10min，倒去大部分上清后，小心吸取其余上清。

③ 加入500ul 75%的乙醇，轻弹管底，使沉淀悬浮，上下颠倒5-8次，8000g室温离心3min，弃去大部分上清后，小心吸取干净其余上清。重复此操作一次

④ 室温放置晾干，加入25ul DEPC水溶解RNA，使用涡旋仪涡旋3min使RNA溶解充分。

⑤ 使用超微量分光光度计测量RNA浓度。

三 逆转录

① 将水浴锅打开，设置37℃保温。根据所得RNA浓度计算需要的RNA体积（1ug），置于冰上，将所需试剂放在冰上融解备用。

② 取1ugRNA于一个200ul的离心管中，加入1ul的gDNA remover buffer和1ul的gDNA remover，加DEPC水补足至10ul。将体系上下颠倒混匀并离心，放在水浴锅上孵育2min后置于冰上备用。

③ 先统一配置后续试剂，一块板有8个样品，在200ul 离心管中加入40ul buffer，40ul DEPC水，10ul 引物，10ul enzyme，混匀离心。向去除基因组DNA反应液中加入10ul 混合好的试剂，成20ul 体系。轻轻混匀并离心。

④ 在梯度pcr仪上设置，25℃ 5min，50℃ 30min，85℃ 5s。

⑤ 扩增好的产物分装成5份（每份4ul）保存于-80℃。

⑥ 备好明天要用的枪头

四 扩增

① 将扩增所用试剂和模板放在冰上融解，模板融解后离心混匀，将sybr避光上下颠倒混匀，不要产生气泡。将模板用DEPC水稀释10倍，3ul产物加27ul DEPC水（200ul 离心管）。在0.5ml 的离心管中配置8ul引物（前），8ul引物（后），200ul mix和184ul DEPC水，总共400ul，共需配置6管。

② 向每个加样孔中加入18ul 配置好的溶液和2ul 稀释后的cDNA模板，用封板膜封好板后离心混匀（2400g，1min）。

③ PCR程序设置为95℃ 30s，（95℃ 10s，60℃ 30s）*40个循环，融解曲线95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s。结束后导出数据。

附: 因为是第一次做，所以很多操作都很稚嫩，感觉在浪费导师的钱财，不知道大家对此有什么看法。