细胞培养基础操作

一、无菌操作

1. 开灯、开风

2. 拿垃圾盒

3. 点酒精灯（除了垃圾盒都不要超过酒精灯）

4. 酒精棉花擦台子

5. 往台子里放移液枪、枪头盒、各种试剂、细胞等

6. 进入操作台和孵箱中的所有东西都要喷酒精（包括手和胳膊）

7. 开盖、关盖之前都要过火

8. 往培养瓶中加液时，枪头高于培养瓶瓶口，悬空竖直

9. 结束后：所有试剂贴封口膜，酒精擦台子，拿出垃圾盒，熄灭酒精灯，关灯，关风，垃圾盒冲水

二、细胞复苏

1、完全培养基配制：DMEM（含1%双抗）+10%FBS（胎牛血清）（培养基种类据细胞而定）

2、新培养瓶内加入４ml完全培养基

3、打开水浴锅（３７℃）

4、取出冻存的细胞，迅速解冻（浸在水浴锅内三分之二，快速摆动至刚好融化）

5、移液枪吸取解冻的细胞液，滴加到２、中的培养瓶中，吸打混匀（刚刚解冻的细胞比较脆弱，滴加和吸打都要缓慢，一滴一滴地加）

6、培养瓶画“8”，使液体平铺

7、放入孵箱

三、细胞换液

1、将培养瓶中的液体倒出

2、PBS洗两遍，2ml/遍

3、加4ml完全培养基

4、放入孵箱

四、细胞传代

1、将培养瓶中的液体倒出

2、PBS洗两遍，2ml/遍

3、加入1ml胰酶，放入孵箱，时间据细胞而定（MCF7是3分50秒、A549是60秒左右、AT是30秒左右、AD是60秒左右）

4、从孵箱中取出培养瓶，显微镜下观察是否消化，然后将胰酶吸出，弃掉

5、加入2ml完全培养液，将培养瓶瓶壁上的细胞吹下来，吹匀

6、分瓶后加入4ml完全培养基，吸打混匀

7、放入孵箱

五、细胞冻存

1、冻存液配制：90%胎牛血清+10%DMSO

2、将培养瓶中的液体倒出

3、PBS洗两遍，2ml/遍

4、加入1ml胰酶，放入孵箱，时间据细胞而定

5、从孵箱中取出培养瓶，显微镜下观察是否消化，然后将胰酶吸出，弃掉

6、加入2ml完全培养液，将培养瓶瓶壁上的细胞吹下来，吹匀

7、将细胞和培养液转移到EP管离心，1000r/min，离心5min

8、将上清液体吸出弃掉，加入1ml冻存液，吸打混匀

9、将冻存液转移到冻存管，标注清楚，贴上封口膜，放入冻存盒

10、冻存盒在-80℃冰箱放一天后，将里边的冻存管拿出来，-80℃冰箱存放

11、冻存管在-80℃冰箱存放一周后转移至液氮罐

12、短期冻存放-80℃冰箱，长期保存放液氮罐

六、细胞铺小皿

1、弃掉培养瓶中的培养液

2、PBS洗两次，2ml/次

3、加1ml胰酶，放入孵箱，时间据细胞而定

4、从孵箱中取出培养瓶，显微镜下观察是否消化，然后将胰酶吸出，弃掉

5、加入2ml完全培养液，将培养瓶瓶壁上的细胞吹下来，吹匀

6、根据细胞情况，吸取部分细胞悬液加到小皿中（细胞多的话加1ml细胞悬液就行，着急用的话多加点儿也行，具体形况根据细胞数量而定）

7、小皿中加入3ml完全培养液，吸打混匀

8、盖子过火盖上，盖子上标记好细胞种类和铺皿日期