脂筏分离新技术

Minute哺乳类动物组织及细胞总脂筏分离 LR-039

脂筏是含有高水平胆固醇和鞘脂的小质膜结构域。 脂 筏 被发现 存在于质膜（ PM ）和 一些内膜系统中，如

线粒体相关膜（ MAMS ）和内质网等。 脂筏 参与 许多细胞过程， 如 信号转导，膜 转运 和蛋白质分选。脂质修饰

的蛋白质和一些跨膜蛋白质集中在脂筏中，而其他蛋白质被排除在外。脂筏 还被 发现与质膜上的 Na / K ATP

酶相关。 传统的脂筏分离方法是用蔗糖梯度法或 OptiPrep 密度法 ，采用超 高速 离心法分离，需要大量的起始

样品 ，而且该方法繁琐、耗时。为了克服传统方法的缺点，我们 利用离心管柱技术开发了这款 简单、 快速 的

脂筏 分离试剂盒 。 首先 将样品的总膜（总膜即质膜 P M 和细胞器膜总和）组分分离 然后 用含有非离子 表面

活性剂的缓冲液 处理， 最 后使用台 式 离心 机 离心分离耐 表面活性剂组分 。 整个过程无需 使用密度梯度和超 高

速离心 ，可以在 90 分钟内从培养的细胞 组织中高度富集脂 筏。

试剂盒组分（20T）：

1. 缓冲液 A 15ml

2. 缓冲液 B 10ml

3. 缓冲液 C 10ml

4. 研磨棒 2个

5. 离心管柱 20个

6. 收集管 20个

操作步骤：

注意：实验前请将缓冲液

C 恢复常温，混匀备用。

1. 将离心管柱 放入收集管中，放置在冰上 预冷， 缓冲液 A 和 B 放在冰上预冷， 但请 不要预冷缓冲液 C

2. A. 对于培养的细胞， 通过低速离心（ 500 600 × g 5 分钟）收集 30 40 × 10 6 个细胞。用预冷 PBS 洗涤细胞

一次。完全除去上清液，将沉淀重悬于 500 μ l 缓冲液 A 中。将细胞悬浮液在冰上孵育 5 分钟 剧烈涡旋

震荡 10 30 秒。 立即将细胞悬浮液转移到离心管柱中。转到第 3 步。

B. 对于柔软组织样本， 将 30 40 mg 组织（新鲜或冷冻）放入离心管柱中。将 200 μ l 缓冲液 A 加入离心管

柱中，用塑料棒 反复扭转 研磨组织， 2 3 分钟。研磨后， 再次加入 300 μ l 缓冲液 A 。转到步骤 3 。 对于肌

肉组织， 将组织放在干净的玻璃或塑料板的表面上 用锋利的刀片将组织切成组织 匀浆 状 。将组织转移

到离心管柱中，并如上所述进行研磨。 塑料棒是可重复使用的，用 70 ％酒精或水清洗 干净即可 。

3. 盖上离心管柱，倒置 混匀 几次，然后 16,000 x g 离心 30 秒。 （此步骤推荐使用可在 10S内达到离心力

的台式离心机，离心机的离心力和升速时间会影响最终得率）

4. 弃去 离心管柱，剧烈涡旋 10 秒钟重悬沉淀。 1000 × g 离心 5 分钟 （沉淀物包含细胞核，大细胞碎片和一

些未破裂的细胞）。

5. 将所有上清液转移到新鲜的 1.5ml 离心管中， 16,000 × g 4 度，离心 30 分钟。沉淀是 总膜 。小心地将所

有上清液 （胞浆部分 转移到新的 1.5ml 管中，如果需要 胞浆组分 保存 即可 。

6. 沉淀中加入 500 μ l 预冷缓冲液 B 重复上下吸打 20 30 次，并剧烈涡旋 10 秒 重悬 。立刻 在冰上孵育 30

分钟 ，期间 每 隔 10 分钟 涡旋 震荡 一次， 并 立即将管子放回冰上，使其始终保持冷却。

7. 将 离心 管 16,000 × g 离心 10 分钟。将所有上清液转移到新的 1.5ml 离心管中 向管中加入 0.5ml 缓冲液

C 并通过短暂涡旋 震荡 充分混合 （管中的溶液变得混浊 。将管在冰上孵育 2 分钟。 10,000 X g 离心 10 分

钟。离心后，脂筏漂浮在管的顶部。

8. 将一个细的 吸管头 （如 SDS-PAGE样品 加样针 插到移液器上，插入管子底部， 缓慢 并 完全地去除水相。

或者，也可以使用配备 21号针 头 的 2毫升注射器。去除水相后，脂 筏会粘附在 离心管 壁上。

9. 加入 200ul预冷的缓冲液 A用移液器上下吹打 10-20次，将脂筏重悬 。 16000 x g离心 5分钟。完全除去

上清液。沉淀是分离的 脂筏 ，可 使用 下面列出的 溶解液 50-200μμl重悬 ，或者根据下游应用情况选择其他

缓冲液 重悬 。根据细胞 /组织类型 不同 ，最终蛋白质产量在 30-100 ug/样品范围内。