外泌体相关研究文献分享,轻松读完一篇文献（十五）

今天分享一篇发表在ACS Nano（2021年IF=15.881）上的文章，名为《Protein Profifiling and Sizing of Extracellular Vesicles from Colorectal Cancer Patients via Flow Cytometry》[1]（流式检测结直肠癌患者细胞外囊泡的蛋白表达和粒径）。

细胞外囊泡(EVs)是一种由几乎所有细胞自然分泌的纳米级膜囊泡，通过RNA和蛋白质等大分子的转移来介导细胞间的通信。这些囊泡由于其越来越多的病理生理学作用和作为诊断和治疗工具的潜在用途，已激发了相当大的科学和临床研究者的兴趣。EV的表面蛋白在反映其亚细胞来源和供体细胞类型方面发挥重要作用，指导它们被受体细胞靶向和捕获，保护它们免受吞噬以减少循环清除。因此，EV的蛋白谱对于理解EV功能、区分疾病相关亚型、预测转移倾向和确定未来转移的器官部位和评估基于EV的药物传递系统的质量是必不可少的。然而，EV从不同的细胞类型(甚至从一种细胞类型)在大小和表面蛋白上高度异质，特定的囊泡亚型可能单独负责特定的功能。如果使用Western blot和ELISA进行分析，这一独特的子集很容易被其他丰富的EV所掩盖。因此，迫切需要一种灵敏、高特异性和快速的方法来在单粒子水平上测量EV上这些蛋白质标记物的丰度。

EV的生物发生途径主要分为外泌体(30−100nm)和微囊泡(100−1000nm)，由晚期内吞小体（被称为多囊泡体）释放或从细胞的质膜中出芽。目前确认和量化单个EV上特异性蛋白表达的方法是使用金标记抗体的免疫电镜(IEM)，但由于程序繁琐，统计能力有限，很难常规应用。虽然流式细胞术(FCM)已经被应用于利用荧光阈值触发分析单个EV的表面蛋白，但专用FCM最小可检测囊泡大小为150−190nm，传统FCM为270−600nm。利用鞘流中的单分子荧光检测策略，我们开发了高灵敏度流式检测技术(HSFCM)，可以使光散射检测直径分别为24nm和27nm的单个二氧化硅纳米颗粒和病毒。在本次研究中，我们报道了一种超灵敏的基于流式检测的方法，用于蛋白分析和将单个EV的检测下限降低到40nm。通过免疫荧光染色和单粒子计数来定量表达特异性蛋白的EV亚群。通过分析结直肠癌患者无血小板血浆(PFP)中CD147阳性EV的颗粒浓度，研究了不同的EV亚群在疾病诊断和治疗监测中的潜力。

研究结果：

一、高灵敏度流式检测技术的单EV分析和纯度评估

来自细胞的EV的两种分泌途径如图1a所示。因为传统的用于分离外泌体或微囊泡的方案通常共分离混合群体的EV，在本研究中，我们通过超离从人细胞培养的条件培养基中分离EV(图1b)。图1c显示了从人结直肠癌细胞系HCT15培养上清中分离的EV的典型冷冻透射电镜图像，并且确定了颗粒的大小和形貌具有很大的异质性。为了能够对单个EV进行多参数分析，原来的实验室建造的双通道HSFCM被升级，配备了三个单光子计数雪崩光电二极管(APD)探测器，用于同时检测侧散射(SSC)和双色荧光(图1d)。与传统的FCM相比，为减少背景，探测区体积缩小到fL级别(∼25fL)，延长纳米粒子在激光束中的停留时间以增强光子的产生，以及单光子计数APD的高量子产率是HSFCM实现显著提高灵敏度的关键。从锥形毛细管中流出的样品流(40μm i.d. 和240μm o.d.)由鞘流体水动力聚焦到一个非常细的流(∼1.4μm)，穿过聚焦激光束的中心区域(直径∼16μm)。图1e(i)显示了通过220nm滤光片的PBS的典型SSC信号，杂质粒子的个数为2−4 events/s。对于从结直肠癌细胞系HCT15中分离出来的EV，我们观察到散射光强度有很大的变化(图1e(ii))。有个别大尺寸纳米颗粒的散射信号饱和了探测器（用实心倒三角形标记▼表示）。图1f描述了SSC爆发面积分布直方图，由PBS（红线）和EV（黑线）分别收集超过2min的数据的分布直方图。EV非常广泛的SSC分布反映了它们在粒径上的巨大内在异质性。

EV的高质量纯化对于下游生化分析的准确性至关重要，如蛋白质组学分析和EV介导的功能mRNA和miRNAs的转移。由于脂蛋白和其他一些污染物不可避免地在分离物中共存，因此评估EV的纯度很重要。我们使用TritonX-100裂解EV的磷脂膜，并检测了处理前后的颗粒。图1g(i)和(ii)显示了在1%TritonX-100处理1小时之前和之后，EV的典型SSC信号分布。在洗涤剂处理后，EV的颗粒数显著降低。我们确定，从不同细胞系的细胞培养上清中分离的EV含有85−90%的膜囊，而从PFP中分离的EV由于血浆中存在大量的脂蛋白颗粒，这一比例下降到70%(图1h)。

二、EV的高分辨率尺寸分布分析

EV的颗粒大小和分布是影响细胞摄取的重要物理特性，包括细胞间的通信和治疗效率。在这里，我们比较了HSFCM与冷冻透射电镜和纳米颗粒跟踪分析(NTA)对EV粒径分布分析的影响。为了获得高质量的EV大小分布，通过80张冷冻透射电镜分析1000多个囊泡，对HCT15细胞分离物进行了表征。尺寸分布曲线如图2a所示，箱宽为10nm。虽然尺寸分布在30~600nm之间，但大约65%的囊泡在30−100nm的尺寸范围内，86%的囊泡在30−200nm的尺寸范围内。EV的峰值位置和中值大小分别为55nm和75nm。为了检验HSFCM在EV绝对尺寸分布分析中的性能，我们合成了一系列单分散二氧化硅纳米颗粒(SiNPs)，并作为尺寸参考标准。图2b显示了47、59、74、94和123nm SiNPs混合物的SSC分布直方图。为了纠正SiNPs（1.461）和EV（1.400）之间轻微折射率差异引起的偏差，根据Mie理论计算导出了每种大小的SSC强度的校正因子。当从拟合的高斯曲线中得到的SSC强度的质心对SiNPs的每个大小总体进行校正时，得到了散射光强度和粒子大小的校准曲线，其大小依赖性为5.01阶(图2c)。因此，EV样品的SSC分布直方图(图1f)可以转换为粒径分布，bin宽度设置为1nm(图2d)。显然，通过HSFCM可以测量到小至40nm的单个EV。请注意，大于175nm的EV在当前仪器设置下饱和了探测器。尽管如此，在对EV样品的2min中检测到的10720 个事件中，饱和检测器的峰数被确定为98个。因此，99%以上的EV群可以通过HSFCM准确表征。测量到的EV的峰值位置和中值尺寸分别为50和64.5nm。NTA还对这五种不同尺寸的SiNPs和EV样品进行了平行分析，其粒径分布直方图分别如图2e和图2f所示。与HSFCM对5个SiNPs群体的基线分离相比，由于严重的峰值展宽，在NTA上获得的大小分布曲线中观察到显著的重叠(图2e)。EV样品测量的峰位置和中值大小分别为105和107.6nm，与冷冻透射电镜和HSFCM测量的相应值有较大偏差。

三、个体EV的蛋白分析

由于目前还没有基于其生物发生来分离EV的纯化方法，因此EV每个亚群的比例不清楚，往往会导致不一致的结果。从HCT15细胞培养上清中分离的EV用常用的外泌体标记物CD9、CD63、CD81偶联单克隆抗体染色。由于HSFCM可以检测到与PE偶联的单一抗体，我们推断免疫染色的单个EV应该很容易被检测到。PE荧光与SSC的双变量点图如图3a所示。10万g超离心回收的EV，CD9、CD63、CD81检测到阳性率分别为55.2%、46.0%和55.0%。通过校准PE荧光强度与单个PE偶联单克隆抗体的荧光强度中位数，可以得到每个EV上结合的单克隆抗体的数量。根据单抗与抗原的1：1结合比，可以得到单个EV上表达的CD9、CD63、CD81的拷贝数分布，如图3b i−iii所示。结果表明，对于表面有特异性蛋白表达的EV，每个EV上CD9、CD63和CD81的中位数拷贝数分别仅为5、6和5。这些结果与文献中报道的关于免疫金标记的代表性TEM图像很一致，尽管经典的TEM方法缺乏统计学上的严谨性。同时，EV中CD9、CD63和CD81的蛋白水平分析采用传统的流式细胞仪(BD FACSAriaIII)，将EV与4μm醛/硫酸乳胶珠孵育和以及与特定的偶联PE的单抗染色。与基于磁珠捕获的分析方法相比，HSFCM的单颗粒分析不仅可以揭示表达特定蛋白质的EV亚群百分比，而且还可以揭示EV亚群内蛋白质拷贝数的分布。值得注意的是，对于EV的IgG-PE结合物的大尺寸可能限制了可以与给定EV结合的探针的数量。此外，抗原聚类可能使igG-抗原结合的空间位阻的情况更糟糕。如果探针可以用有机染料标记的小配体取代，如抗原结合片段(Fab)、单链可变片段(scFv)、附着体或适配体，测定的抗原表达拷贝数可能更准确。

然而，为了研究CD9、CD63和CD81在单个囊泡表面的共表达，我们采用双免疫荧光染色法分析了相同的EV样本。图3c显示了PerCP-Cy5.5红色荧光与PE橙色荧光的双变量点图。共表达CD9/CD81、CD63/CD81和CD9/CD63的EV亚群分别为31.8%、31.1%和22.3%。除了共同表达两种蛋白的EV群体的自然减少外，由于空间位阻，也可导致两种蛋白的低效免疫荧光标记阳性率降低。

四、结直肠癌细胞系中CD147阳性EV的分析

尽管使用EV作为癌症诊断的生物标志物的潜力一直很有前景，但临床样本中特异性EV亚型的定量仍然具有挑战性。CD147是一种对乳酸转运很重要的跨膜蛋白，在某些人类肿瘤类型中过表达。最近，从结直肠癌细胞系中分离的EV中证实了高水平的CD147表达，并使用光敏化珠检测了从结直肠癌中分离的循环CD147/CD9双阳性EV。在这里，我们应用HSFCM分析了从结直肠癌细胞系(HCT15和HCT116)和正常结肠成纤维细胞系(CCD-18Co)中分离的EV上CD147的表达（图4）。从不同细胞系分离的EV的CD147 PE荧光与SSC的双变量点图表明，CCD-18Co细胞分泌的只有不到10%的EV群体CD147阳性(图4a)，而结直肠癌细胞系的则接近50%(图4b，c)。来自癌细胞系的EV的CD147表达水平的升高表明了其在癌症诊断中的潜在应用价值。HSFCM提供了几个比传统的分析方法优势：Western blot分析显示了样品中相对的蛋白量(图4d)，HSFCM还揭示了表达CD147的EV的百分比，并可以在单粒子水平上将蛋白质丰度与囊泡大小相关联。例如，CD147阳性的EV根据其细胞来源表现出不同的大小分布，例如，HCT15细胞的尺寸小，HCT116细胞的尺寸大（图4）。

五、结直肠癌患者及健康供体血浆中CD147阳性EV的分析

结直肠癌的死亡率为40%−50%，早期诊断已给予适当的早期干预至关重要。由于CD147水平在正常和癌细胞系中存在差异(图4d)，我们试图确定CD147水平是否可以用于区分从结直肠癌患者（n=37）和健康人（n=32）血液样本中分离的EV（表1）。分离过程如图1b所示，仅需50μL的PFP就足以进行HSFCM分析。我们首先使用罗丹明B异硫氰酸酯(RBITC)封装的直径80nm的荧光SiNPs测量血浆中的颗粒浓度（图5a）。我们发现，癌症患者和健康人的血浆浓度在不同个体间可相差40-50倍，而平均EV浓度没有显著差异（图5b和表2）。然后，我们用PE偶联抗体荧光染色分析CD147阳性EV的颗粒浓度。图5c显示了从患者样本中分离出的EV的PE荧光与SSC的双变量点图，其中CD147阳性的EV为15.4%。使用已知颗粒浓度的100nm橙色荧光球来校准样品流速，测量CD147阳性EV的血浆浓度。29图5d显示，健康供体CD147阳性EV的平均浓度为（4.1±2.3）×10^7颗粒/mL，结直肠癌患者的平均浓度为（2.9±2.9）×10^8颗粒/mL，有差异显著(P<0.001)。图6所示的ROC曲线显示，CD147阳性EV（来自结直肠癌患者和健康供体）的浓度显示了一个优秀的分类器，AUC为0.932。同时，在所有癌症期患者中，甚至是I期患者中，均发现CD147阳性EV水平升高(图5e)。这些结果表明，CD147阳性EV的颗粒浓度可能有助于结直肠癌的早期诊断。在术前和术后（术后第7天−10天）分析血液样本时，16例结直肠癌患者中有13例在手术切除后CD147阳性EV的颗粒浓度显著下降(P<0.05)(图5f)。虽然还需要更多临床样本，以进一步验证使用CD147阳性EV进行结直肠癌诊断和治疗监测的可行性，这一结果表明，使用疾病特异性EV亚群的颗粒浓度在诊断和预后方面具有巨大的潜力。

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参考文献：

[1]Tian, Y; Ma, L; Gong, M; et al.Protein Profiling and Sizing of Extracellular Vesicles from Colorectal Cancer Patients via Flow Cytometry.[J].ACS Nano.2018,12(1):671-680