免疫组织化学（IHC）

免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）

石蜡标本制备、石蜡切片见帖子：石蜡标本制备。

一、IHC（ABC法，三步法）

1、脱蜡至水

• 二甲苯 10 min x 2次
• 无水乙醇 5 min x 2次
• 无水乙醇:二甲苯(1:1) 5 min #可无此步骤
• 95%乙醇 5 min
• 90%乙醇 5 min
• 80%乙醇 5 min
• 70%乙醇 5 min
• 双蒸水（ddH2O）洗 1min

2、抗原修复（见下文第三部分）

3、阻断内源性过氧化物酶：过氧化物酶阻断剂（试剂1）[3] 30 min。清洗。

4、封闭：正常山羊血清封闭液（试剂2）[3] ，室温封闭 1 h。不清洗，甩干即可。

5、一抗：PBS稀释一抗，4℃过夜。清洗。

6、二抗：生物素标记山羊抗兔IgG聚合物（试剂3）[3] 1 h。清洗。

7、辣根酶标记链酶卵白素工作液（试剂4）[3] 1 h。清洗。

8、DAB显色：DAB显色试剂盒[5]（1ml底液+1滴母液=工作液，避光保存，配置后30min内用完），显色时间 5 min（显色时无需避光，根据一抗调整显色时间，阳性显色为棕色），自来水中止显色。

• 显色时间不是固定的，首次做需要在显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗。

9、核染：苏木素染核 3 s，冲洗干净。1%盐酸酒精分化 5 s，冲洗干净返蓝。

• 使用 Weigert 苏木素效果更佳：Weigert 苏木素 5 min，分化 15s，冲洗干净返蓝（见番红O-固绿染色）。

10、梯度脱水、二甲苯透明。

• 70%乙醇 5 min
• 80%乙醇 5 min
• 90%乙醇 5 min
• 95%乙醇 5 min
• 无水乙醇 5 min x 2次
• 二甲苯 5 min x 2次

11、中性树脂封片。

二、二步法

1、脱蜡至水，抗原修复。

2、阻断内源性过氧化物酶：过氧化物酶阻断剂（试剂1）[6] 1h。清洗。

3、一抗：PBS稀释一抗，4℃过夜。清洗。

4、复温后，使用反应增强剂（试剂2）[6] 1h，清洗。

5、二抗：酶标山羊抗兔IgG聚合物（试剂3）[6] 1 h。清洗。

6、DAB显色，核染，梯度脱水、二甲苯透明，中性树脂封片。

三、抗原修复

1、胰酶法：将无 EDTA 的 0.25% 胰酶用 PBS 或 ddH2O 稀释至 0.1%。免疫组化笔画圈，37℃ 孵育 1h。清洗。

2、热修复（脱片，不建议使用）：配制柠檬酸钠抗原修复液[4]（50X，用三蒸水或PBS稀释至1X），高压锅法或微波炉法进行热修复（方法如下），修复后自然冷却至室温（约1.5h），免疫组化笔画圈（IHC全程注意不要干片，但画圈时干片对结果无影响[2]）。

• 高压锅法（脱片）：将切片置入高压锅（勿使用玻璃容器，以防爆炸），高压锅上汽后 5 min。
• 微波炉法（严重脱片）：微波炉加热至沸腾（火力P100，1.5min）。将切片置入后，①加热1min（火力P30），停止30s，②加热1min（火力P30），停止30s，③加热1min（火力P30）。# 微波炉加热柠檬酸钠抗原修复液3min（火力P100，100ml烧杯）发生爆炸，原因未知。

四、注意事项

1、脱蜡要充分：石蜡不溶于水，如果脱蜡不充分，会引起染色不均匀，阳性结果时隐时现、真假难辨等问题。

2、进行抗原修复：特别是在石蜡切片中，组织在固定液中固定后会导致蛋白见交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性，若不行抗原修复，可能看不到阳性结果。

===============

参考文献

[1]组织免疫荧光应该怎么做？ - 知乎 (zhihu.com)

[2]余光银,陈耀丽,蔡广玲,王子慧,尹为华,罗明华.干片对免疫组化染色结果的影响[J].临床医学工程,2010,17(04):45-47.

[3]中杉金桥SP-9001兔SP试剂盒（兔链霉卵白素-生物素法检测系统） SP-9001 SPlink Detection Kits （Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems）_价格-厂家-供应商_北京诺博莱德科技有限公司_丁香通 (biomart.cn)

[4]柠檬酸钠抗原修复液（50×）_IHC（免疫组化）_其它实验试剂_蛋白与免疫_索莱宝-专业生化试剂网上商城 (solarbio.com)，说明书：名称 (solarbio.com)

[5]中杉金桥ZLI-9018 DAB显色试剂盒.zsbio.com - ZLI-9018，说明书：ZLI-9018.pdf (zsbio.com)

[6]中杉金桥PV-6001兔二步法试剂盒( 免聚合物法检测系统) 说明书：ZM-0325 (zsbio.com)