利用棕榈酸/棕榈酸钠/BSA配置高脂细胞培养基，诱导心肌细胞、内皮细胞凋亡等的关键点

2型糖尿病是一种以糖脂代谢异常为主要表现的慢性代谢性疾病。在体外研究中，为了模拟2型糖尿病所致的器官损伤，除在细胞培养基中添加高浓度的葡萄糖外，通常需要添加高浓度的软脂酸（棕榈酸，Palmitic acid）或软脂酸钠（棕榈酸钠，Sodium palmitate）。然而，现有配制方法不当，市场上也无可直接使用的软脂酸或软脂酸钠细胞添加剂，导致很多从事2型糖尿病的科研工作者无法顺利开展体外细胞实验。

现有技术中，部分技术人员采用甲醇、乙醇、氢氧化钠溶液等溶剂配制软脂酸或软脂酸钠，其缺点是这些溶剂本身对细胞就有毒性，而且这些溶剂是否影响软脂酸或软脂酸钠本身的性质也不清楚。

本文建议：利用牛血清白蛋白（BSA）可与软脂酸、或软脂酸钠结合的特点，采用高浓度的BSA溶液配制软脂酸、或软脂酸钠，形成高脂细胞培养基/游离脂肪酸培养基。

配置完成后，再参考如下案例进行实验。

【案例一】高糖高脂细胞添加剂剂量依赖性诱导心肌细胞凋亡

图中，分别给予H9C2心肌细胞30mmol/L葡萄糖和100、200、300、400µmol/L梯度浓度的棕榈酸钠（High lipid）、溶剂对照（Control）或空白对照（Blank），24小时后，进行Annexin V-FITC（横坐标）、碘化丙啶（Propidium iodide, PI，纵坐标）双染，采用流式细胞仪检测细胞凋亡（Annexin V-FITC阳性、PI阴性，右下象限黑色框内），图A~图G是流式细胞检测结果，图H是细胞凋亡率的统计结果。

需要说明的是，高糖高脂细胞添加剂的有效成分是棕榈酸钠（Sodium palmitate，10mmol/L）和葡萄糖（Glucose，1mol/L），溶剂不能含有NaOH或有机溶剂，确保对细胞无毒性。 上述成分适用于所有类型的细胞，可用于诱发细胞脂毒性、诱导内质网应激、氧化应激、线粒体损伤、细胞凋亡等。

【案例二】高糖高脂细胞添加剂剂量依赖性诱导内皮细胞凋亡

图中，分别给予小鼠主动脉内皮细胞30mmol/L葡萄糖和100、200、300、400µmol/L梯度浓度的棕榈酸钠（High lipid）、溶剂对照（Control）或空白对照（Blank），48小时后，采用Western blotting法检测Cleaved caspase-3的蛋白水平。图A是Western blotting检测结果，β-actin是参照蛋白，图B是统计结果。

需要说明的是，相关操作步骤可以参考如下：

1. 针对不同细胞种类及实验目的，棕榈酸钠所用浓度不同，一般与细胞培养基按1:100-1:20稀释，终浓度为100-500umol/L。葡萄糖终浓度一般为25-30mmol/L，但需考虑培养基中现有葡萄糖的浓度。

2. 对于首次使用，建议采用浓度梯度处理细胞，摸索针对特定细胞、达到特定效果的适宜浓度。

3. 需要经0.22μm滤器过滤除菌，待细胞生长至80-100%汇合度时，换成新鲜含血清（一般10%）培养基，按适当浓度滴加棕榈酸钠和葡萄糖溶液，对照组加入等量高脂和高糖对照，轻柔混匀后将细胞放入细胞孵箱中继续培养。

4. 加入20-48小时后，收集细胞，进行下一步分析。

【参考文献】

1）Cardiac-specific CGI-58 deficiency activates the ER stress pathway to promote heart failure in mice，Cell Death & Disease（www.nature.com/cddis）

2）Optimization of Porphyran Extraction from Pyropia yezoensis by Response Surface Methodology and Its Lipid-Lowering Effects，marine drugs

3）Lipid-induced DRAM recruits STOM to lysosomes and induces LMP to promote exosome release from hepatocytes in NAFLD，SCIENCEADVANCES

4）High-fat diet impairs ferroptosis and promotes cancer invasiveness via downregulating tumor suppressor ACSL4 in lung adenocarcinoma，Zhangetal.BiologyDirect

5）Monocyte-derived extracellular vesicles upon treated by palmitate promote endothelial migration and monocytes attachment to endothelial cells，Biochemical and Biophysical Research Communications 523 (2020) 685e691

6）The impact of sitagliptin on macrophage polarity and angiogenesis in the osteointegration of titanium implants in type 2 diabetes，Biomedicine & Pharmacotherapy 126 (2020) 110078