互补单链DNA退火成双链结构指南（siRNA及探针合成）

在开始之前我想跟大家理清楚两个容易混乱的概念，primer和oligo。primer（引物）做为PCR的一个重要部分引导着DNA合成方向，也就是方向指引。而oligo指寡聚核苷酸序列，包括引物，也包括一些非引物用途的短核苷酸链，比如siRNA的两条单链，还有做为探针的短DNA链。

退火（Annealing）：是指将材料暴露于高温环境中持续一段时间，再缓慢冷却到低温的热处理步骤，退火在各行各业都有用到。这里主要讲生物实验中的退火。对于Oligo来讲，退火过程的主要目的是用于形成DNA的高级结构，如茎环、发夹、双链或其他结构（注意千万不要讲引物退火，引物没有退火一说）。生物实验中的退火，在siRNA的合成、探针合成以及分子克隆中常常要用到。

1.溶解oligo：拿到oligo干粉产品之后，对管子进行瞬时离心8000rpm、1min，加入退火缓冲液进行溶解。推荐溶解成比较高的浓度，建议50μM以上浓度。如oligo因浓度较高而不溶解，可以加热并搅拌促溶。

2.体系配置：精确测定每个Oligo溶液的浓度(如果干粉溶解，直接计算成一致，就不必检测)，按照等摩尔混合（溶解时摩尔浓度一致就等体积添加）。两条oligo退火形成双链，摩尔数不同会导致多余的单链残留。单链发夹或茎环的退火可跳过此步骤。

Annealing Buffer 5X 配方：50 mM Tris, pH 7.5-8.0, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA

（其中：Tris起到pH缓冲作用，EDTA起到防止oligo降解的作用，盐离子对于DNA双链的形成是必要的，NaCl可以用KCl替代。配制退火缓冲液，需要高温灭菌，并使其中的脱氧核糖核酸酶失活，如果用于siRNA退火，需要保证RNase-free）

3.退火程序：

注1：每8秒下降0.1℃，降至25℃的程序设置，以Bio-Rad的T100为例为：1. 95℃, 2:00; 2. 95º, 0.08, -0.1℃ per cycle; 3. GOTO step 2, 700X; 4. 4℃, ∞。

注2：如果所用的PCR仪不具备下降0.1℃的功能，也可以设置为每90秒下降1℃。程序设置以Bio-Rad的T100为例为：1. 95℃, 2:00; 2. 95℃, 1:30, -1℃ per cycle; 3. GOTO step 2, 70X; 4. 4℃, ∞。

注3：将水加热至96°C，倒入保温瓶中，将管子套在浮漂上放入，缓慢降温（一般情况下降至室温即可）。缓慢降温对形成正确的结构是非常有帮助的，降温过快将导致错误高级结构的产生。

4.纯化：将产物用PCR纯化试剂盒进行纯化，纯化后可直接用于后续连接、转染或EMSA实验等，也可以冻存在-20°C中。

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