细胞支原体鉴定

细胞培养中支原体的检测（翻译自Nature Protocol）

PS：因为正好学习PCR检测支原体，所以就顺手翻译了一下，语言有些生硬，请多包涵，附件附上原文。

摘要

支原体是一种原核生物，是细胞培养中常见而隐蔽的污染物。这种生物体可以改变细胞生理学的许多方面，使用污染细胞进行的实验变得毫无价值。由于支原体体积小，可通过用于防止细菌和真菌污染的滤菌器，并可能污染实验室中的培养试剂及耗材。所有进入实验室的新细胞以及细胞库定期进行支原体检测至关重要。本文推荐使用以下技术中的两种技术进行支原体检测：1、PCR法，2、间接荧光染色法，3、琼脂和肉汤培养法。上述三种方法，需要1天到3-4周的时间，支原体检测应成为实验室质控的强制性组成部分。

引言

细胞培养过程中支原体污染是非常普遍的，在已发表的文献中感染率为5-35%。细胞受污染后生理学的许多方面均发生了变化，因为将对实验结果产生不良影响。所有进入实验室的新细胞、培养物都需要进行支原体检测，并制定常规检测制度。本文介绍了支原体的三种检测方法。

支原体的介绍

支原体是一种微小的、球形或丝状的原核细胞微生物，属于细菌界-柔膜菌门-柔膜菌纲-支原体目-支原体科-支原体属&脲原体属，共有100多种。这也是为什么一种检测技术难以准确检测出污染的原因之一。肺炎支原体具有致病性，但大多数支原体不具有致病性。细胞培养中最常发现的物种是舌支原体、口腔支原体、精氨酸支原体和无胆甾原体。支原体体积小，易变形，可以通过用于组织培养基消毒0.22μm的滤菌器。支原体缺乏细胞壁，常用的抗生素对支原体无效。支原体浓度达10⁸个/mL，依然不会引起培养基浑浊，且不影响细胞的生长。因此，支原体在常规细胞系培养中很难被发现。许多细胞低水平的污染只能采用高度灵敏的方法来检测。因此，不检测支原体或采用方法不够灵敏的实验室被感染的可能性很高。尽管污染多来自血清等实验试剂和人员感染，污染源也可能是其他受感染的培养物。除此之外，用于培养的饲养层细胞，如人胚胎干细胞系可能污染它的支持细胞。

支原体检测

支原体的检测方法多种多样（见表1），包括选择性微生物培养基分离，直接或间接荧光染色，ELISA，放射自显影，免疫染色，直接或巢式PCR。琼脂培养通常被认为是“黄金标准”检测法，但是即使使用这种检测法，也可能会漏掉某些需要特殊培养条件的支原体。因此，建议使用肉汤/琼脂培养法、间接荧光染色法和PCR法中的两种技术进行检测。

支原体检测有一些基本原则。细胞培养的规程和预防措施见相关的Nature Protocol。用于检测的样品应尽可能新鲜制备，因为储存或快速冷冻可能会减少具有活性的支原体的数量。培养物必须在没有抗生素的情况下培养至少3次或至少2周时间。每次检测都必须包含适当的阳性和阴性对照。如果发现支原体污染，应如何处理? 如果在处于隔离区的新细胞系中发现污染，则应该丢弃这些细胞或采用抗生素治疗支原体。用抗生素治疗支原体细胞是一个漫长的过程（≥3个月），但会成功。如果在常规组织培养实验室中发现污染，细胞培养工作应立即停止，并丢弃所有存活的培养物。培养箱、超净台表面必须彻底清洁和消毒，在从细胞库取出新鲜培养液并重新检测所有细胞之前，必须丢弃所有部分使用的培养基。

Nature Protocol的期望之一是，一个合格的研究生应该可以在最少的指导下完成方案。鉴于支原体污染在组织培养实验室的重要性，以及在优化检测和结果解读方面需要大量的经验，实验室应对经验不足的人员提供培训，并确认他们获得的任何阳性或阴性的结果。

流程概况

在文描述了三种检测支原体的方法，建议检测过程选择其中的两个进行。

（A）    琼脂/肉汤培养：在可能的情况下，每项实验都必须包含阳性对照。然而，对于支原体检测，提供阳性对照需要在环境中生长活的有机体和/或被污染的细胞。使用阳性对照可能损害实验室无菌性，建议外包检测。应该注意的是，对于疫苗生产中的检测，与细胞培养有些小的不同，要符合欧洲药典(第六版,2007年,部分2.6.7)和CBER / FDA的指导方针 (支原体检测,21 CFR 610.30, http://www.accessdata.fda.gov/scripts/ cdrh / cfdocs cfcfr / CFRSearch.cfm ? fr = 610.30)。

（B）    间接荧光染色：采用结合DNA的荧光染料如Hoechst 33258或DAPI (4 '，6- diamidino-2-phenylindole)染色，检测培养细胞的支原体污染情况。由于支原体含有DNA，可以看到小的荧光点或斑点，集中在细胞表面，周围培养基和培养皿上。相反，细胞核呈荧光椭圆形。不建议对培养物进行直接染色，因为，细菌污染的DNA或细胞降解的DNA可能会产生小的荧光点，在支原体浓度较低的情况下，结果难以解释。因此，有必要用来自测试细胞的培养基感染一种已知支持高水平支原体增殖的报告体系。Vero （细胞）是最常用的报告体系，除此之外，3T6, MDCK和A549也适用于报告体系。

（C）   直接PCR：PCR可能会出现假阳性和假阴性。PCR检测的可靠性取决于该方法的灵敏度、检测样品的质量和引物的特异性。该方法需要在现实条件下进行优化。可选择的引物多种多样，如单一的、多路的和嵌套的，具有一定的敏感性和特异性。大多数引物使用高度保守的序列，试图检测广泛的支原体物种。下面直接PCR流程可用于检测一系列柔膜菌，包括莱茵支原体，精氨酸支原体，发酵支原体，烟支原体，口腔支原体，肺炎支原体，鸡腐烂支原体，滑膜支原体和柑橘螺原体，这些种类是欧洲药典明确认为细胞培养和种系发育中比较常见的污染。同时该流程还可以检测关节炎支原体，生殖支原体，人型支原体，穿支原体，唾液支原体，解脲支原体，牛支原体，肺炎支原体和鹅毛支原体。所使用的引物来自16S rRNA基因中的一个保守区域，但不能检测真核生物DNA或与支原体有密切系统发育关系的细菌，如梭状芽胞杆菌、乳酸菌和链球菌。PCR法应采用以下对照：

-阴性对照样品：无菌水或生长培养基样品，必须产生阴性结果，即PCR凝胶上没有可见条带。

-阳性对照样本：来自支原体污染的细胞系或标准支原体有机体的样本，如Acholeplasma laidlawii，必须产生阳性结果，即在PCR凝胶上有清晰可见的条带。

-标准支原体生物：已知支原体物种的标准制剂。

材料&试剂

琼脂和肉汤培养法

-支原体琼脂平板和肉汤(品牌：Mycoplasma Experienc或Difco)。琼脂平板和肉汤也可以在实验室制备。

-阳性对照：经认证的支原体参考菌株（见 http://www.wfcc.info ），如欧洲医药和保健质量理事会(http://crs.edqm.eu)或专业公司（如Mycoplasma Experience）或者也可使用已知的支原体污染细胞株。支原体污染的细胞系或标准支原体生物的样品，必须产生阳性结果，即PCR凝胶上可见的清晰条带。

间接荧光染色

-Hoechst 33258 (Sigma, cat. no. 861405)

-报告体系培养基

-报告细胞株体系（如Vero）

-荧光染色封片剂（Vector laboratories, cat. no. H-1000）

PCR

-10× CoralLoad PCR buffer（品牌：HotStar Taq Plus DNA polymerase kit; Qiagen, cat. no. 203605），-20℃保存，直至最大有效期。

-HotStar Taq Plus DNA polymerase (品牌：HotStar Taq Plus DNA polymerase kit; Qiagen, cat. no. 203605) ，-20℃保存，直至最大有效期。

-Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) mix (10 mM) (品牌：Promega, cat. no.U1511) ，-20℃保存，直至最大有效期。

-上游引物MGSO (5′-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3′), (10 μM)，-20℃保存，避免反复冻融。

-下游引物GPO-3 (5′- GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT-3′), l (10 μM) ，-20℃保存，避免反复冻融。

-DNase-free水(品牌：Qiagen, cat. no. 129114)

-DNeasy blood and tissue kit (品牌：Qiagen, cat. no. 69504)（DNA提取试剂盒）

-标准支原体生物（如Acholeplasma laidlawii，品牌：Mycoplasma Experience)）

琼脂糖凝胶电泳（直接PCR的一部分）

-超纯的琼脂糖-电泳级（品牌：Invitrogen, cat. no. 15510–027）

-10× TBE (162 g Tris + 27.5 g 硼酸 + 9.3 g EDTA +超纯水定容至1L, 用冰乙酸调节PH至8.3) (品牌：Media Services, NIBSC)；

-超纯无菌水 (品牌：Media Services, NIBSC)

-SYBR Safe DNA gel stain 10,000× concentrate in DMSO (核酸凝胶染料，品牌：Invitrogen,cat. no. S33102)

-含300bp的DNA ladder（品牌）

设备

-琼脂-肉汤培养

37℃，5%CO2培养箱、无菌离心管（1或2mL）、II类微生物安全柜、培养皿、显微镜

-间接荧光染色

荧光显微镜、24孔板、无菌盖玻片、II类通风柜

-PCR

1.5mL离心管、200ul离心管或PCR-96孔板、温度循环仪、微型离心机、凝胶电泳、电子秤、锥形瓶、 微波炉、凝胶制备罐、电泳槽、凝胶成像系统

步骤

（A）    琼脂和肉汤培养法（3-4周）

1、培养细胞至少用无抗生素培养基培养3代或2周（以较高者为准）；

2、接种0.1-0.2 ml的无抗生素细胞悬液(新鲜样品最佳，否则4℃下保存最多2周)，装入装有1.5 ml支原体肉汤的小瓶，并置于支原体琼脂平板表面。37°C，5% CO2孵育28 天；（注；每次试验均进行支原体阳性对照，以确保支原体在使用的肉汤/琼脂板上生长）。

3、3-5天和14天从肉汤传代到琼脂板。按上述方法孵育。

4、每周在显微镜下观察琼脂平板，注意是否有支原体菌落(典型外观：“煎蛋样”，如图1，但有时呈不典型菌落)。在孵育28天后记录结果，丢弃肉汤和琼脂板。

（B）    间接荧光染色（10天）

1、培养细胞至少用无抗生素培养基培养3代或2周（以较高者为准）；

2、在无抗生素培养基中培养细胞7天或达到浓度/密度的峰值。同时，将报告细胞接种到置有无菌爬片的24孔板内（10-20000个细胞/2.5cm2）。(注：报告细胞状态必须好，即健康/半融合状态，在测试时处于指数生长阶段，以便后期染色。)；

3、在报告细胞中加入1mL测试细胞的培养基；

4、37°C，5% CO2孵育3天；

5、用移液管除去培养基(如果使用真空吸引器，则应在使用后通过吸入漂白剂通过管道仔细消毒，以防止通过管道的交叉污染)。（注：操作动作要轻柔，因为多数支原体吸附在细胞或者培养皿表面；部分支原体会残留在培养基中，如果必要，可通过细胞离心机旋转和染色来测试但实际操作中并不推荐，因为设备很难灭菌，这个过程会传播染）

6、用培养基或PBS冲洗细胞。

7、编号，细胞固定至少5分钟（冰醋酸+甲醇，1:3新鲜制备)。

8、除去固定液，蒸馏水冲洗，干燥（如果无法及时进一步实验，可在室温保存）；

9、在爬片上加Hoechst 33258（50ng/mL，蒸馏水配置），室温染色10min。

10、除去染色液，蒸馏水洗3遍。

11、用细针加一点防荧光淬灭封片液，加盖玻片，荧光显微镜使用330/380-nm激发过滤器和440-nm阻挡过滤器产生紫外荧光检测培养物。注：紫外线是有害的，会灼伤眼睛，并可能对视力造成永久性损害。因此，如果使用的是一种缺乏安全功能以防止眼睛暴露的显微镜，则必须对学员和偶尔使用紫外线显微镜的人员进行全面的培训和解释屏障滤光片的重要性。

（C）   PCR（4-5h）（注：全程戴手套）。

1、收集贴壁细胞上清或悬浮细胞1ml，置于离心管中，离心（200g，1min），上清液转移到新管中，作为PCR的模板；。

2、制备预混溶液（可以根据自己购买的产品参考说明书）。

3、预混液配置（现在很多公司卖ready to use 的预混液）

4、配置 反应体系50 uL，

取1 μl上清/支原体阳性对照 + nuclease-free 40.75 μl + 预混液8.25 μl，调整最终反应体积至50 μl。

抑制性对照反应：1 μl上清 + 1μl支原体阳性对照 + nuclease-free 39.75 μl + 预混液8.25 μl，调整最终反应体积至50 μl。

离心除去气泡；

5、扩增：

6、琼脂糖凝胶电泳

2g琼脂糖，加入含有100mL TBE1X (2%)。

微波炉加热溶解，1分钟，然后检查琼脂糖混合物是否溶解。如果没有，重复微波程序，直到琼脂糖完全溶解（注意加热过程中防止蒸发）。

在琼脂糖混合物中加入10 μl SYBR Safe DNA凝胶染色剂（具体看购买试剂盒的说明），将凝胶混合物倒入凝胶制备槽中。

根据测试样品的数量，将15、20或30孔的梳子放入凝胶混合物中。

等待约30min至琼脂糖凝固。

拔梳子，在电泳槽中倒入1x TBE 覆盖胶的表面。

7、上样：PCR 扩增样品/100bp 的DNA ladder 18uL，电压100v，1h。

8、曝光。

时间

步骤1(A)，琼脂和肉汤培养法：结果在3-4周内获得(5-10分钟设置琼脂平板或肉汤;3-5 d和14 d时间点检查平板和传代培养5-10 min;28 d后孵育结束，检查约5-10分钟。一般3-5 d可见菌落，除非污染水平较低)。

步骤1(B)，间接荧光染色：10 d内得到结果(15分钟细胞铺板，5分钟培养基转移到报告细胞系，30分钟染色检查细胞)。

步骤1(C)， PCR: PCR在4-5 h内得到结果，(PCR前准备 30-60 min，PCR 2.5h，琼脂糖凝胶电泳1h)。

 结果预测

图1是用琼脂和肉汤培养法从污染培养液中培养出支原体菌落的例子。

在间接染色的细胞中，细胞核被染成蓝色。如果这些样本中有支原体污染，在高倍镜下可以看到散布在细胞和细胞周围塑料上的亮蓝色斑点或斑点。如果结果不明确，则应重复试验。

图2 直接PCR的典型凝胶照片。编号从左到右，第1、7、13条为100 bp DNA ladder;泳道2：阴性对照; 泳道3，测试样品A; 泳道4：测试样件B；泳道5：测试样件C; 泳道6：测试样品D; 泳道8：抑制控制阴性控制; 泳道9：测试样品A的抑制控制; 泳道10：测试样B的抑制控制; 泳道11：测试样C的抑制控制; 泳道12：测试样D的抑制控制; 泳道14：阳性对照。

使用PCR的结果通过比较检测样本与阳性对照反应的PCR产物的存在和大小来解释。阳性对照和抑制对照应该都显示270 bp的条带，而阴性对照应该在该区域没有条带(图2)。只有阴性对照给出阴性结果，阳性对照和抑制对照都给出阳性结果时，测试才被认为是有效的。如果使用PCR结果模棱两可(例如,270bp的条带是模糊的)，疑似污染可以通过接种到报告细胞上放大可以的污染。然后将接种的细胞株孵育几天以培养和支持高水平的支原体增殖，然后收集培养基进行PCR检测。

对于抑制PCR反应的检测样本(显示抑制控制反应中没有270-bp条带)，则重复如框1所示的PCR。

Box1

PCR检测样品为抑制PCR反应

(1)  将贴壁细胞或悬浮细胞上清置于离心管，200g 室温离心1min。

(2)  将上清转移到一个新离心管，丢弃沉淀。

(3)  上清22000g离心15分钟。

(4)  小心地倒上清。用100 μl PBS重悬颗粒(可能看不见)。

(5)  使用商业上可用的DNA提取试剂盒，如DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen)，或类似的试剂盒提取DNA。提取的DNA作为PCR的模板。

(6)  进入PCR程序，余步骤同前。