国自然中标热点分析：线粒体掀起新热潮！中标率持续飙升！

众所周知，2020年和2021年国自然中标项目信息获得难度非常大，小编有幸获得2021年度国自然医学部2371条（面上、青年、地区项目），而国自然医学部今年共资助项目大概为10,000个左右，那么小编的数据可基本代表2021年国自然中标热点趋势，统计如下：

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国自然趋势

中标量近几年都呈增长趋势

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相关机制介绍

线粒体简介：

线粒体（mitochondrion）是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包被的细胞器，是细胞中制造能量的结构，是细胞进行有氧呼吸的主要场所，被称为"power house"。其直径在0.5到1.0微米左右。

线粒体拥有自身的遗传物质和遗传体系，但其基因组大小有限，是一种半自主细胞器。除了为细胞供能外，线粒体还参与诸如细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。

线粒体为细胞内的能量工厂，对细胞的增殖、分化、存活以及稳态的维持起着重要的调节作用。在生物的生长、发育、代谢、衰老、疾病、死亡以及生物进化等方面，线粒体参与其中进行调控或信号传导，且还参与细胞内Ca2+的稳态、活性氧的产生以及细胞色素C的释放。

线粒体的功能状态与线粒体膜电位、线粒体膜通道、线粒体Ca2+浓度、ATP生成、呼吸链复合体活性、活性氧生成以及DNA突变密切相关。

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近年国自然线粒体相关部分项目

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研究经验获取

国自然定题思路上：适当避开心肌细胞线粒体等研究较多的领域，根据最新文献去延伸定题，目前线粒体自噬创新性尚可。

方案设计上：根据项目的具体方向来确定检测指标，如凋亡相关则需检测线粒体细胞色素Ｃ、线粒体膜电位等指标；如自噬相关则需检测自噬相关因子；如重点探究氧化磷酸化则需重点检测ROS、ATP，复合物I/IV活性等。

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部分线粒体功能的检测

1.线粒体膜电位

目前常用的是采用荧光染料探针方法结合流式细胞术来检测线粒体膜电位。亲脂阳离子荧光染料是评估M M P的常用工具，如罗丹明123(Rhod123)、四甲基罗丹明甲酯(tetramethylrhodamine methyl ester,TMRM)、四甲基罗丹明乙酯(tetramethylrhodamine ethyl ester,TMRE)和四氯四乙基苯并咪唑羰花菁碘化物(5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethyl-imidacarbocyanine,JC-1)等。

罗丹明123是最初使用的检测线粒体膜电位的荧光染剂，具有较好的灵敏性，可使用流式细胞仪或荧光分光光度计检测荧光值的变化。

JC-1比罗丹明123具有更高的灵敏性，当线粒体膜电位升高时，JC-1聚集于线粒体基质中，形成JC-1聚合物，产生红色荧光；当线粒体膜电位较低时，JC-1以单体的形式存在，产生绿色荧光，可采用荧光显微镜或流式细胞仪对线粒体膜电位作定性和定量的分析。JC-1尽管能产生不同的荧光，但经常受到线粒体环境的影响。因此，这些探针不适用于复杂生物系统中的精确原位分析。

2.MPTP检测

线粒体膜通透性转换孔(m i t o c h o n d r i a l permeability transition pore,MPTP)是线粒体渗透转换功能的结构基础，是线粒体内外膜结合处的一种蛋白性通道。

一般检测MPTP的方法有分光光度法、活性物质标记法、膜片钳法等。

膜片钳技术是一种可以记录通过细胞膜上离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一或多个离子通道活动的技术，其反映的电流特征也可以用来评价线粒体的功能。全自动膜片钳技术效率高，操作技术简单，但仅适用于悬浮细胞的检测。相对于活性物质标记法、膜片钳法，分光光度计更加简便常用。

近来研发了一种新的荧光探针技术为活体细胞线粒体膜通道孔（MPTP）荧光检测试剂，它是一种通过钙黄绿素-钻技术（聚集在线粒体内的钙黄绿素呈现荧光染色，而存在于胞浆或由线粒体释放到细胞质中的荧光染料即刻发生荧光淬灭）来分析和观察线粒体膜通道孔活性的技术方法，操作简单的同时具有较高灵敏度。

 3. 线粒体Ca2+的检测

线粒体Ca2+的检测方法包括沉淀法、电化学分析法、EDTA整合滴定法、火焰光度法（flame photometry）、原子吸收分光光度法等。

其中电化学分析法是最方便的。经过不断地研发，荧光探针Quin-2AM、fluo-3/AM和indo-1AM同样可以测量线粒体中的钙含量。

最近发现了一种钙-罗丹明123（ho damine 123）的复合物，可以特异性地聚集在线粒体中通过荧光分光光度仪来定量检测线粒体内Ca2+的含量。这种方法适用于各种活体细胞内线粒体Ca2+的浓度检测，操作简便、性能稳定，具有较高的灵敏性。

4. 线粒体ATP测定

现今已经有几种技术来测量细胞内ATP水平，包括层析、电泳、高效液相色谱法（hig h performance liquid chro matography，HPLC）以及由不同激酶催化的反应以及利用荧光素酶的酶促反应等分析方法。

酶学方法的一个限制是使用UV吸光度或激发使得测定易于受到被测样品的吸光度或荧光的干扰，灵敏度低，操作起来较为复杂。

HPLC采用Eco sil系统，设定紫外波长、温度等，以标准曲线计算ATP、ADP等的含量。HPLC可检测出不同状态细胞能量物质的差异，其具有操作简便、快速、重现性好等优点。

5. 活性氧的检测

通用的检测活性氧的方法有化学发光法、紫外-可见吸收分光光度法、荧光光度法以及选择性电极法等。

化学反应法的特点是测定灵敏度高、廉价、操作简便等。但是，化学反应法的特异性相对比较差，一些氧化还原反应或者酶催化反应往往对测定结果的判断产生影响。

用荧光探针MitoSOX检测线粒体活性氧，用荧光探针检测具有简便、灵敏、背景低、线性范围宽、用时短、检测效率高的优势。但是由于荧光本身的可淬灭性，因此它需要即时检测拍摄并防光线直射。

6. 线粒体DNA的检测

线粒体DNA损伤可利用DNA测序技术、ASO探针杂交、DNA芯片技术、单核苷酸多态性、实时荧光定量聚合酶链反应技术、限制性片段长度多态性分析（RFLP）及高效液相色谱技术等进行检测。

测序仍然是异质变异检测的金标准，尽管其异质性检测限相对较低。与测序相比，微阵列方法具有高通量的显著特征，具有测试周期短、成本低的优点，可应用于临床诊断领域。

聚合酶链式反应（PCR）是扩增DNA标本的方法之一，但是在引物结合区域中会存在mtDNA异质性，产物中重叠区域和非重叠区域之间的覆盖程度变化很大，该方法的准确性不够。

定量实时PCR（qPCR）能够实时监测被扩增的DNA分子的数量，因此它有助于确定单个细胞中mtDNA的拷贝数，以及其他的mtDNA功能（如大规模缺失）。该方法材料要求低、成本低，可以检测高分辨率的检测。

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国自然干货分享

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三、申请书撰写技巧与中标经验分享

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基金申请经验分享

基金申请体会

经验与心得

四、国自然申报书撰写模板

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经费预算表模板

可行性分析撰写示例

年度研究计划及预期研究结果示例

重点模块写作提纲

五、2021年申请参考资料

2021年度NSFC模板

六、中标标书案例的解读及优劣分析

5个经典中标标书案例的解读及优劣分析

2022年国自然申请备战已拉开序幕，线粒体依然如火如荼，不同的细胞条件，不同的细胞类型，不同的生活活动特征，不同的病理背景，线粒体都需要更多深入的研究，选好标书方向就成功了一半，大家加油！