药物递送（八）——铁蛋白技术

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铁蛋白具有显著的热稳定性、pH稳定性、生物相容性、生物降解性、粒径均匀性，内部具有空腔，成本低，可规模化生产，可通过化学或者基因途径表面修饰达到高效率靶向， 使其成为一种极具潜力的药物递送载体。

文丨花花

校&编丨塔卡拉玛干的白杨

一 、概 述

1.    定义

铁蛋白(Ferritin，FRT）于1884被Schmiedeber发现，1937年法国科学家Laufberger从马的脾脏中成功将其分离并命名为铁蛋白，1965年Richter从恶性肿瘤细胞株中分离出铁蛋白，并发现铁蛋白存在于各种组织和体液中。

铁蛋白是一种脱铁蛋白组成的具有大分子（450KD）结构的糖蛋白，由24个亚基自组装形成的蛋白质外壳和铁内核两部分组成，每个铁蛋白分子可贮存4500个铁原子。铁蛋白参与铁代谢，在维持机体铁代谢平衡和细胞抗氧化过程中起着关键作用，并且与炎症、血管增生和肿瘤有关。

人工条件下的铁蛋白是具有中部空腔结构的笼形（cage-like）结构，外径为12nm，内径为8nm。其空腔结构可以装载药物，实现药物的包载和递送。同时，铁蛋白外壳可通过基因和化学修饰增加靶向性，以达到提高递送效率的目的。此外，铁蛋白具有自组装能力和高热稳定性，适用于多种制备技术。

尽管肿瘤靶向机制还未明确，但是早在20世纪60年就开始研究铁蛋白和肿瘤之间的关系。经过多年的探索，铁蛋白已于2005年成功用于包载递送阿霉素（Dox），开启药物递送领域新篇章。中科院生物物理所阎锡蕴课题组在总结近十年研究后，首次提出铁蛋白药物载体（Ferritindrug carrier，FDC）的概念。

图1 铁蛋白药物载体的发展历程

2.铁蛋白递送药物的优势

（1）安全性

铁蛋白是来自生物体内的天然存在蛋白质，毒性低，具有良好的生物降解性和生物相容性，不容易引起排异反应。

图2 铁蛋白和铁蛋白药物载体

（2）渗透和滞留性

作为载体，铁蛋白的粒径为12nm，这使得它在血液循环中，易于逃脱网状内皮系统（Reticuloendothelial system，RES）的吞噬，循环时间长，有较长的半衰期。同时可利用增强渗透与滞留效应（EnhancedPermeability and Retention effect，EPR），增强药物在病变部位的蓄积，增强药效。

（3）稳定性

铁蛋白对温度和pH的承受能力强，能在很宽的pH范围内保持原有的中空结构，且能在75℃的高温下保持10分钟。铁蛋白的结构会在极端酸性或碱性条件下分解成亚基，当pH值恢复到生理范围时结构重组恢复笼状结构。足够稳定的理化性质能避免药物在制备和存储期间发生泄露，也可选用高能量的制备技术用于生产，同时铁蛋白的提取纯化工艺也会简便很多。

（4）靶向性

先天肿瘤靶向性：给药后在血液循环过程中因EPR效应，有效富集于肿瘤组织。由于肿瘤细胞的的旺盛生长，对铁离子的需求远大于正常细胞，使得肿瘤细胞表面的转铁蛋白受体（Transferrinreceptor 1，TFR1）过度表达。只有当TfR1表达量达到固定阈值时，铁蛋白才会进入细胞，并在肿瘤细胞特有的酸性微环境下释放包载药物。因此铁蛋白药物载体能结合细胞表面转铁蛋白受体的膜蛋白，经转铁蛋白受体的介导，选择性地富集到肿瘤细胞并在溶酶体中释放包载的药物。所以包载药物的铁蛋白，即使没有附加额外的“定位系统”，也能自动识别癌细胞，大大提高疗效，同时降低生产的难度和成本。

脑靶向性：由于铁蛋白可跨越血脑屏障（Blood-brainbarrier，BBB），且转铁蛋白受体在血脑屏障中的表达水平明显高于正常细胞组织，转铁蛋白受体可协助重链铁蛋白在血脑屏障内外转运。铁蛋白能通过脑内皮细胞的转胞吞作用穿过血脑屏障，而不被阻断在溶酶体中。因此，铁蛋白是优良的治疗脑部疾病的药物载体，并有潜力成为多种中枢神经疾病药物载体。

图3 铁蛋白载体在脑靶向中的作用示意图

二 、制备方法

尽管铁蛋白的载药方法有很多种，但根据载药过程中铁蛋白的行为可分为三类：第一类是让药物通过铁蛋白的通道，主动包载到笼状结构内，这种方法的整个制备过程不改变铁蛋白形态；第二类是先将铁蛋白笼状结构解聚，充分与药物孵育后再让铁蛋白的笼状结构重组；第三类是介于前两者之间，用变性剂扩宽铁蛋白的通道，再利用主动载药将药物包载在笼状结构内。

图4 铁蛋白载药方式示意图

1.     物理孵育法

因铁蛋白纳米笼状结构具有8个亲水通道和6个疏水通道，这为金属离子及其他小分子药物进入笼状结构中提供了有效途径，因此可直接将铁蛋白与将要包载的药物分子进行混合孵育，利用铁蛋白的空腔对药物进行包载。但对于分子量较大的药物，包载效率会大大降低。

铜离子可用于物理孵育铁蛋白包载阿霉素。先将铜离子和阿霉素孵育形成复合物，该复合物能顺利通过铁蛋白的亲水通道，使铁蛋白的笼状结构完成对药物的包载。疏水性药物则可利用疏水通道完成药物包载，例如吉非替尼、酪氨酸激酶抑制剂等。

孵育法也适用于基因工程构建的共递送亲-疏水药物的铁蛋白药物载体。将疏水肽-亲水肽-RGD肽功能性基序替换人重链铁蛋白（Humanheavy chain ferritin，HFn）亚基的第五螺旋，使多肽功能基序在铁蛋白外表面。通过铁蛋白的亲水性药物通道和笼外表面上展示的疏水性肽，孵育一定时间，将亲水药物表阿霉素和疏水药喜树碱分别装载到铁蛋白笼状结构的内腔和外表面。

该方法的缺点除了不能包载大分子药物外，因其包载机制的限制，载药量和包封率皆不高，还有很大的改善空间。

图5 双靶向铁蛋白及其抗肿瘤作用机理示意图

2.    pH 介导的解聚/重组法

物理孵育法是通过铁蛋白结构中疏水通道和亲水通道进行药物包载，但对于分子量较大的药物，因其通道狭小无法使药物分子进入空腔结构内，pH介导的解聚/重组法则可用于大分子药物的包载，其基本原理是利用酸碱度变化使铁蛋白笼状结构完成一次解聚和重组，在这个过程实现对药物的包载。

铁蛋白能在很宽的pH范围内保持笼状结构的稳定，但是当大幅度反复改变铁蛋白溶液pH值时，可使铁蛋白笼状结构的亚基发生解聚与重组的互相转化。在极度酸性或碱性条件下, 蛋白亚基发生解聚, 而当溶液 pH 值恢复到中性时, 解聚的亚基又可以重新自组装恢复成笼状结构，并对药物进行包载。和其他方法相比，这种pH值依赖的解聚/重组特性, 更利于其对药物的包载。

图6 pH介导的解聚/重组法示意图

pH介导的解聚/重组法用于包载米托蒽醌的过程中，将铁蛋白溶液pH值先后调节到2.5实现笼状结构的解聚，与药物溶液混合培养后，再将铁蛋白溶液pH值调至7.5实现笼状结构的重组，并将小分子药物米托蒽醌包载入铁蛋白纳米笼状结构中。

图7 pH介导的解聚/重组法包载米托蒽醌示意图

pH介导的解聚/重组法用于包载顺铂的过程与包载米托蒽醌一样，将铁蛋白溶液和顺铂溶液混合后，先将pH值调至2.2使铁蛋白笼状结构解聚，室温下培养后将pH值调回7.5，室温下搅拌1小时，铁蛋白笼状结构重组，并将顺铂包载其中。对混合溶液超滤洗涤，去除未包载的游离顺铂。包封在铁蛋白内的顺铂储存在− 20℃条件下。

该方法需要摸索合适的pH，因为不同类型的铁蛋白解聚和重组所需的pH值不同，例如普通的铁蛋白需要在pH值低于2或者高于11时才能解聚，而变型后的铁蛋白，则需要在pH值低于4时才能解聚。该方法的缺点则是太极端的pH环境可能会永久性破坏铁蛋白，引起药物包载能力和稳定性的下降，并且工艺转化也存在一定难度，不适用于酸碱敏感药物。

3.    尿素梯度法

铁蛋白在低浓度变性剂中稳定存在，而在高浓度变性剂作用下发生变性。尿素梯度法是指将铁蛋白与尿素溶液混合, 通过铁蛋白先变性后复性的过程实现对药物的包载。即首先将铁蛋白与高浓度尿素溶液混合而使其完全解聚成亚基, 之后将需包载的药物加入其中, 并将尿素溶液浓度递减, 逐渐完成铁蛋白笼状结构的复性并完成对药物的包载。

根据尿素浓度的不同，包载方式存在一定的差异。当尿素浓度过高时，铁蛋白的笼状结构完全解聚，此时是利用铁蛋白结构重组包载药物；当尿素的浓度控制在一定范围内时，铁蛋白的笼状结构并未完全解聚，此时是通过尿素溶液扩宽笼状结构的通道，让更多或分子量更大的药物进入笼状结构内。此法虽然载药量较高，但效率却较低。

利用天然H-铁蛋白（HFn）包载阿霉素时，将铁蛋白混合于高浓度尿素中，旋转一段时间至完全解聚，将阿霉素加入其中。培养一定时间，用含阿霉素的尿素缓冲液梯度透析（尿素浓度逐渐减小），再去除游离阿霉素，即用铁蛋白笼状结构包载阿霉素。

三、药物递送

普遍认为药物从铁蛋白载体中释放的机制是溶酶体对铁蛋白的酸化作用，使药物从铁蛋白的笼状结构中释放出来，但尚未有明确定论。尽管如此，已有研究数据表明铁蛋白递送药物能降低非特异细胞毒性和提高疗效，并且能减小毒副作用，例如顺铂的癫痫和阿霉素的心脏毒性，是理想的递送系统。

图8 铁蛋白包载和输送药物示意图

铁蛋白可用于化疗、辐射疗法、光热疗法和基因疗法，同时又可以增加靶向能力实现高效递送。尽管铁蛋白对癌细胞有天然的靶向性，但可进一步通过在铁蛋白的表面修饰某些化学物质，以便通过选择性识别驱动纳米颗粒朝向特定细胞，进一步增加靶向性。

图9 铁蛋白药物载体的应用

1 .递送药物

目前铁蛋白作为药物载体，主要用于递送小分子化学药物和大分子核酸药物。

（1）   小分子化药

小分子药物包括金属药物和非金属药物。金属药物如顺铂、卡铂，这些药物化学稳定性和水溶性较差、细胞渗透性低，限制其临床应用。非金属药物有阿霉素、链霉素、阿托品。

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