酚氯仿法提取血凝块DNA

本傻子求学路上的一些小心得，让其他人少走点弯路。有什么可以改进的还请不吝赐教。

实验原理

先从血凝块中分离出有核白细胞，再通过SDS和蛋白酶K消化破碎细胞，然后通过酚/氯仿抽提去除蛋白质，最后使用乙醇沉淀得到DNA。

注意：本法中多种试剂有毒有害且能通过呼吸道及皮肤吸收，且能穿透普通乳胶手套，请谨慎操作。

实验用品

仪器

电子天平、研磨棒、低温离心机（4°）、移液枪一套、涡旋混匀仪、旋转混匀仪、恒温水浴箱、通风橱、低温冰箱

试剂

1M TE buffer（PH8.0）、10%SDS、蛋白酶K（20mg/ml）、超纯水、酚试剂、酚氯仿试剂（亦可自己配置苯酚：氯仿：异戊醇25：24：1）、氯仿、无水乙醇、3M 乙酸钠、75%乙醇

耗材

一次性吸管、2ml离心管、1.5ml离心管、10ul tips、200ul tips、1ml tips、滤纸

实验准备

水浴箱37°预热，无水乙醇-20°预冷，高压灭菌完的耗材。

实验步骤

第一部分：获取DNA

1.用一次性吸管吸取500ul血凝块放入2ml离心管中，使用研磨棒不断研磨直至血液呈泥沙样。加入1ml TE缓冲液涡旋混匀，12000rpm×5min离心。(血凝块的量可根据目的需求更改，缓冲液加入后不超过离心管载量即可)

血凝块中纤维蛋白网罗着血细胞，其中大量是无核红细胞，少量有核白细胞，而DNA就在白细胞胞核中。因此，本步骤中需要充分研磨，破碎红细胞的同时尽量使白细胞暴露出来。

2.离心后弃上清，沉淀加入1mlTE，涡旋混匀，12000rpm×3min离心。

3.重复步骤2 5-6次，直至沉淀呈米白色。

多次洗涤去除可能存在的分离胶等杂质和多余的红细胞，只留下白细胞沉淀。

4.沉淀加入400ul TE，涡旋混匀后，加入25ul 10%SDS，5ul 20mg/ml PK，混匀后放入37°水浴锅中消化过夜（8小时），每隔一段时间上下颠倒混匀。（可适当增加消化时间和PK酶量增强消化效果）

混匀及隔时间混匀保证酶与底物充分接触。SDS剧烈摇晃会产生大量气泡，影响消化效果，因此加入后轻柔进行。

第二部分：提纯DNA

1.在通风橱内，消化液中加入等体积酚（可适当过量保证抽提效果），放在旋转混匀仪上每分钟30转混匀15min，然后12000rpm×10min离心。

使用前检查离心管密闭性，液体泄漏将导致DNA损失。有机溶剂容易将标记抹去，离心管按顺序放置有助于分辨样本。

2.使用100ul规格移液枪吸取上层，动作轻柔，尽量吸完上层液体的同时少吸入中间层杂质。转移上层液体至新的2ml离心管（记住吸取了多少量）。

上层为水相，中间为薄的蛋白层，下层为有机相，酚可使蛋白质变性而被去除，而DNA溶于上层水相中。

3.新离心管内加入等体积酚氯仿试剂，放在旋转混匀仪上每分钟30转混匀15min，然后12000rpm×10min离心。

酚与氯仿互溶，酚试剂和酚氯仿试剂中上层为防止其变性的保护液，不要吸取

4. 使用100ul规格移液枪吸取上层，动作轻柔，尽量吸完上层液体的同时少吸入中间层杂质。转移上层液体至新的2ml离心管（记住吸取了多少量）。

上层依旧为水相，中间为蛋白层，下层为有机相。氯仿有强烈的脂溶性，可去除脂类杂质，且氯仿可以将多余的酚去除，因为酚会抑制酶反应，影响后续实验。异戊醇使分层清晰，更易吸取水相。

5. 新离心管内加入等体积氯仿，放在旋转混匀仪上每分钟30转混匀15min，然后12000rpm×10min离心。

6.使用100ul规格移液枪吸取上层，动作轻柔，与上两次不同，为防止吸入杂质可适当少吸取上层液体。转移上层液体至新的1.5ml离心管（记住吸取了多少量）。

7.加入两倍体积的-20°无水乙醇和十分之一体积的乙酸钠，轻柔颠倒混匀后即可看见絮状DNA沉淀（量不大则肉眼看不见，但是后续能有结果）。-20°沉淀1小时，12000rpm×10min离心。

DNA不溶于乙醇因此可析出沉淀。乙酸钠中钠离子平衡电荷有助于DNA充分沉淀。低温降低DNA溶解度。

8.弃上清，加入800ul 75%乙醇洗涤沉淀，12000rpm×5min离心。

75%乙醇除去盐离子。

9.弃上清，倒扣离心管于滤纸上干燥约20分钟后，沿壁加入50ul TE溶解。短期保存于4°，长期保存于-20°

干燥使乙醇充分挥发，但过分干燥会导致DNA固化为白色沉淀，不易溶于TE。

常用试剂配制方法

1M TE buffer（PH8.0）：

1M Tris.cl （PH 7.4~8.0）

10ml

0.5M EDTA (PH8.0)

2ml

水定容至

1000ml

1M Tris.cl（PH 7.4~8.0）：Tris 碱121.1 g溶于800ml 水中，浓Hcl调PH值。溶液冷却后测PH值，加水定量至1000ml，高压灭菌。

PH值

浓Hcl

7.4

70ml

7.6

60ml

8.0

42ml

0.5M EDTA（PH 8.0）：EDTA NA2·2H20 186.1 g，加水 800 ml ，剧烈震荡，搅拌溶解10M NAOH (约 50 ml)调PH值至8.0(PH值达8.0时 EDTA才能溶解)，加水定量至1000 ml，高压灭菌。

1M Hcl：通风条件下，浓Hcl 86.2ml加入到913.8ml水中。

5M NaOH：NaOH 200g 加入水1000ml溶解。

10%SDS：SDS 50g 加水至500 ml，68°水浴助溶，5M NaOH调 PH值至7.2，降温后析出，故每次用前应加热促溶(透明)。无需高压灭菌。

3M 乙酸钠：将408gNaAC·3H2O溶于水，用3mol/l乙酸调至PH 5.2，补加水至1L / 取180 g 无水乙酸钠,加水定容到1000 mL，用3mol/l乙酸调至PH 5.2。