芒果文献101.趋化因子与CD8 T细胞浸润的相关分析

跟专门做研究的科研人员相比，医生有天然的弱势——没有时间。科研思维的锻炼又必须踏踏实实、认认真真地阅读文献，归纳出其中的内在逻辑。关于纯生信论文分析套路，芒果已推出生信论文百篇和生信技能系列。但是，仅仅是纯生信分析甚至包括R语言等还不足以支撑我们认识疾病的本质，我们还需要掌握实验技能，阅读最前沿的文献，以获得概念性的知识，提升个人认知。

为此，芒果精挑细选一系列文献，每篇文献都会按照其逻辑详细解读，并以概念性知识的方式呈现。当然，在这个过程中，芒果还会结合生信分析尽可能挖掘出潜在的课题。由于时间问题，每篇文献将分成多个小主题进行分享。

芒果文献的首篇文献是路德维希肿瘤研究中心George Coukos团队在Cancer Cell发表的题为“Cooperation between Constitutive and Inducible Chemokines Enables T Cell Engraftment and Immune Attack in Solid Tumors”的文章。

主流观点认为肿瘤组织驻留的免疫细胞往往已被驯化，发挥抑制免疫的作用；在肿瘤微环境中，外周迁移的抗原呈递细胞和CD8 T细胞，CD4 T细胞是抗肿瘤免疫的主力军。免疫细胞迁移到肿瘤中是一个精心调控的过程，包括与内皮细胞的粘附、跨内皮迁移、通过细胞外基质和基质的浸润，以及最终植入。肿瘤血管系统在 T 细胞归巢到肿瘤中起着关键作用。其中，趋化因子决定白细胞的迁移行为，但它们如何在稳定状态下调节肿瘤免疫反应尚不清楚。

根据其表达，趋化因子被认为是组成型（稳态）或诱导型（炎症）。组成型趋化因子通过次级淋巴器官和组织调节免疫细胞的生理运输。诱导型趋化因子在炎症部位上调，并在免疫刺激下将激活的效应白细胞募集到组织中。趋化因子调节肿瘤中的免疫细胞运输，并与肿瘤的发展、进展和血管生成有关。

大多数肿瘤形成局部趋化因子网络，通过募集基质细胞（如肿瘤相关巨噬细胞，髓源性抑制细胞和调节性 T 细胞）来促进其生长。髓源性抑制细胞和调节性 T 细胞 与患者预后不良有关。最近研究发现，趋化因子在 T 细胞募集到肿瘤中的作用。例如，CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CXCL9 和 CXCL10 的表达与黑色素瘤中肿瘤浸润淋巴细胞的存在相关。此外，干扰素-γ诱导的趋化因子 CXCL9、CXCL10 和 CXCL11与肿瘤微环境内 Th1 细胞激活以及对黑色素瘤化疗和免疫治疗的有利反应有关。CCL4 是一种关键的趋化因子，可招募表达BATF3的树突状细胞，这是黑色素瘤中 T 细胞炎症和免疫治疗反应的重要决定因素。卵巢癌等肿瘤表达多种趋化因子。肿瘤细胞中 Th1 型趋化因子 CXCL9 和 CXCL10 的表观遗传沉默已被确定为卵巢癌免疫逃逸的可逆机制。总的来说，趋化因子是肿瘤中 T 细胞归巢的关键，但趋化因子在肿瘤微环境中调节的具体机制尚不清楚。这就是作者对科学问题的凝练！然后展开科研探索。

那么，两个问题，①人体有多少种趋化因子；②如何筛选其中最关键的因子呢？第一个问题，目前已经确定的趋化因子列表如下（来自医学免疫学教材），总共40种！正如表中所列，这些趋化因子主要由免疫细胞分泌产生。那么，肿瘤细胞是否可以产生呢？答案是肯定的！而且极有可能每种类型肿瘤分泌的趋化因子类型也不同。

第二个问题，如何筛选发挥关键作用的趋化因子？免疫组化+qRT-PCR+测序+生信。

免疫组化和qRT-PCR，主要是阐明CD8A是CD8 T细胞的Marker，而不是CD3D。上图是主图，下图是辅图。

通过微阵列测序结果筛选关键的趋化因子（算是高通量）。

通过TCGA结果筛选关键的趋化因子（生信验证）。

We confirmed by qPCR the positive correlation between CD8A and CCL5 or CD8A and CXCL9 in an independentset of 57 ovarian cancer specimens, as well as the correlation between CD8A and CD3E and CD247, encoding CD3 subunits epsilon and zeta, respectively.（实验严谨）。

可以说，作者两各Figure（Figure1 + Supplementary Figure1）的结果就是一篇论文。鉴于CD8+ T 细胞在免疫介导的肿瘤排斥和预测许多实体瘤临床结果中的关键作用，作者选择CD8A作为基因标记来量化癌症中的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）【作者关注点是CD8 T细胞】。在所有趋化因子中（前期必定作过大量筛选准备工作，从40种趋化因子中选择相关性比较好的结果展示），只有CCL5和CXCL9 的表达与CD8A 的表达在多种肿瘤类型中呈现一致性（图 1C-1E）。其他趋化因子没有在所有肿瘤类型中表现出与CD8A 的这种普遍相关性。匹配的散点图显示，CXCL9和CD8A以及CCL5和CD8A在七种实体瘤中的表达成正相关（图 1F）。在分析TCGA数据时，也发现一致的结果（图 S1 C-S1E）。在一组独立的 57 个卵巢癌标本中，通过qPCR证实CD8A和CCL5或CD8A和CXCL9之间的正相关，以及CD8A与CD3E和CD247之间的相关性，分别编码 CD3 亚基 epsilon 和 zeta（图 S1 F）。进一步研究趋化因子表达与CD45+白细胞 (PTPRC )、CD4+ TILs (CD4 )、Treg 细胞 (FOXP3 )、自然杀伤细胞 ( KLRB1 )、CD11b+单核细胞 ( ITGAM )、巨噬细胞 ( CD68 )、髓系 DCs ( ITGAX ) 和 BATF3 +DC（BATF3）谱系标志物表达的关联。没有发现CCL5和CXCL9与任何上述基因或者谱系标记物相关（图 S2A和 S2B，下图）。因此，针对9000多个肿瘤标本的分析揭示， T 细胞浸润与CCL5和CXCL9存在特定而普遍的相关性。

因此，作者的一系列验证非常严谨，算得上是高通量筛选，光说数据分析这部分就花费不少时间，工作量很大。如果我们仔细分析上述结果，其实非常多的趋化因子在不同肿瘤类型的肿瘤微环境中表达上调。这些上调的趋化因子都可以拿来尝试进行生信分析。在生信百篇中，芒果曾经分享过趋化因子的论文。

在前文中，我们已经分享作者对趋化因子与肿瘤中CD8 T细胞浸润的相关分析。由于这些分析基于微阵列测序结果，再加上免疫组化和RT-qPCR验证，全景式地展现出生信分析思路。可以说，Figure1 + Supplementary Figure1的结果加起来就是一篇不错的生信论文。第一部分可以得出结论，CD8 T 细胞浸润与CCL5和CXCL9存在特定而普遍的相关性（Thus, analysis of over 9,000 tumors reveals a specific and universal association of T cell infiltration with CCL5 and CXCL9）。

然后，作者开始查找CCL5和CXCL9的细胞来源。为什么会有这样的想法呢？这就涉及到趋化因子的定义。由多种细胞分泌的对不同细胞具有趋化作用的细胞因子，统称为趋化因子（chemokines）。目前已经发现50多种趋化因子（上次推文中40种医学免疫学八年制二版附录得来）。根据其N端氨基端半胱氨酸的排列方式，可分为CXC、CC、XC和CX3C四个亚族：

根据其趋化作用的细胞类型不同，可以分为如下几类：

上述分类都是根据趋化因子的结构或受体等来判断的，但是对于其来源并没有明确。一般认为，肿瘤部位的炎症反应导致免疫细胞浸润，而被募集的免疫细胞产生趋化因子，从而发挥抗炎等免疫反应。那么，事实情况如何，目前连教科书也没有给出明确的阐释，因为不清楚。我们知道，肿瘤微环境中除了免疫细胞，还有肿瘤细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞等多种细胞成分，当然还有非细胞成分。

因此，作者进一步探究CCL5和CXCL9的来源就显得意义非凡。由于CCL5是可溶性蛋白成分，直接用免疫组化检测肿瘤标本是最好的办法。作者使用上皮性卵巢癌 (epithelial ovarian cancer ，EOC) 来表征 CCL5 与肿瘤浸润淋巴细胞的关联。在上皮性卵巢癌组织微阵列（n=522）中，~75% 肿瘤表达 CCL5，而且表现出 ieCD8+ 肿瘤免疫浸润的肿瘤中~95%为CCL5表达（ie为intraepithelial缩写，表示上皮性瘤内 ，图 2A）。事实上，CCL5+肿瘤比CCL5-肿瘤更可能表现出ieCD8+ 肿瘤免疫浸润（54% vs 8%，p=2.2×10^-16）。在不同的队列中（UPenn，n=86），79% 病例表达 CCL5，并且 ieCD8+肿瘤免疫浸润在 CCL5+中的频率高于 CCL5-肿瘤（图 2B）。在两个队列中（n=608），CCL5定位于肿瘤细胞簇中，特别是在肿瘤细胞内（图 2C，有点牵强，可能是根据病理特征来判断的）。

通过多光谱成像显微镜确认肿瘤细胞 CCL5的原位表达（图 2D），其中 CCL5 与细胞角蛋白（肿瘤细胞标志物）共定位，并通过检测FACS 分选卵巢癌细胞，用RT-PCR确定肿瘤中的CCL5 mRNA水平（图 2E）。

这是在卵巢癌肿瘤标本中的检测，那么在卵巢癌的细胞系中，是否存在这种情况呢？许多已建立的卵巢癌细胞系中检测到CCL5 mRNA，表明该趋化因子在卵巢肿瘤细胞中的组成型表达（图 S3A）。这里如果作者结合CCLE数据库做相印的生信验证就更好了。补充数据S3B是对分选的白细胞和肿瘤细胞分别进行检测，证实肿瘤细胞是CCL5表达的主要来源。然而，作者没有检测到CCL5受体（CCR1、CCR3或CCR5）在卵巢肿瘤细胞系上的共表达（图S3A）。

CCR5是CCL5的主要受体，CCL5通过CCR5趋化T细胞。既然肿瘤细胞表达CCL5，那么其受体极有可能表达在肿瘤浸润免疫细胞上。其实，通过多色荧光染色结果，肿瘤细胞簇和表达 CCL5的肿瘤细胞附近存在更多CD8+的T 细胞（图 2D）。与外周血检测结果相比，肿瘤微环境和腹水的淋巴细胞中富含更多CCR5+的T 细胞。图2F）。事实上，肿瘤微环境和腹水的大部分 CD8 +和 CD4 + T细胞表达CCR5（图2G）。因此，肿瘤微环境中 CCR5+淋巴细胞的频率高于外周血 T 细胞（图2H）。

接下来，作者探究肿瘤内在致癌事件是否会导致 CCL5 丢失。这个问题当然也很重要，但是芒果认为该结果放在这里比较突兀，因为涉及机制的探讨。个人认为，如果是为后文埋下伏笔，完全可以放在补充数据里，或者就放到后面探究机制时再做呈现。我们暂时先进行解读。

在卵巢癌、黑色素瘤、肺癌、乳腺癌和结肠癌中，不表达或低表达CCL5与CCL5基因5'UTR区DNA甲基化的增加相关联（图2I），也就是CCL5启动子的高甲基化会导致CCL5表达下调。同时，DNA甲基转移酶抑制剂5'-aza-2'-deoxycitine特异性抑制甲基化酶的作用后，4个卵巢癌细胞系（4/4）中CCL5 的表达上调（图 2J）。相反，使用可诱导 EZH2 蛋白消耗的广谱性组蛋白甲基化抑制剂 3-Deazaneplanocin A (DZNep) 处理， 仅有1个卵巢癌细胞系（1/4）呈现出CCL5的表达上调（图 2J）。这些结果表明，肿瘤细胞组成型表达的CCL5可能与卵巢癌肿瘤微环境中CD8 T细胞募集有关；而且CCL5表达的缺失，部分是由于表观遗传沉默导致的。作者通过相关分析挖掘出CCL5的主要来源——肿瘤细胞，抛开甲基化导致CCL下调的机制部分，这部分数据挖掘过程还是非常精彩的。反过来，从肿瘤细胞分泌趋化因子导致肿瘤预后差异等角度出发，探究趋化因子在肿瘤免疫过程中的作用，也是不错的方向。

尽管大多数CCL5-肿瘤缺乏ieCD8+ T细胞浸润，但小部分CCL5+肿瘤显示ieCD8+ T细胞浸润。这表明CCL5是细胞迁移所必须的，但还不够（Although most CCL5- tumors lacked ieCD8+ TILs, a fraction of CCL5+ tumors showed ieCD8+ TILs, suggesting that CCL5 is necessary but not sufficient for T cell engraftment）。这句话还是很难理解的！根据Figure2A，CCL5-肿瘤中CD8+ T细胞浸润和不浸润比例约为1：9；在CCL5+肿瘤中CD8+ T细胞浸润和不浸润的比例约为1：1。如果CCL5是细胞迁移所必须的，那么CCL5+肿瘤中CD8+ T细胞浸润的比例应该是接近100%才对，这里却只有50%左右。因此，作者给出 CCL5 is necessary but not sufficient for T cell engraftment的结论。

由于前期已经证明，除了CCL5以外，CXCL9也与CD8+ T细胞浸润有关，那么是不是CXCL9在协同或者弥补CCL5的趋化作用呢？因此，作者进一步探究CXCL9表达与CD8A表达的相关性。在UPenn队列中，作者发现所有具有ieCD8+ T细胞浸润的卵巢癌组织都表达CXCL9，而缺乏ieCD8+ T细胞浸润的卵巢癌则不表达CXCL9（图 3A）【确认Figure1的结果】。而根据免疫染色结果，几乎只在表达 CXCL9 的肿瘤中检测到 CD8+ T细胞的浸润（图 3B)，同时，肿瘤浸润淋巴细胞密度与CXCL9的表达相匹配 (图 3C）。根据图3C，CXCL9+细胞主要分布在肿瘤细胞簇周围，且CXCL9+细胞的比例较低（CXCL9+ cells were mostly detected around the tumor islets, and only some were found within）。在引流淋巴结中，作者同样观察到CXCL9+细胞（未显示）。

通过多色荧光技术，作者确认CXCL9+细胞主要是CD68+肿瘤相关巨噬细胞和CD11c+树突状细胞（图3D, 3E）。通过流式细胞术证实，CD11c+的树突状细胞（未显示）以及CD14+CD11b+HLADR+CD141+CD16-CD3-CD1C-的肿瘤相关巨噬细胞均表达CXCL9，而外周的循环单核细胞不表达CXCL9（图S3C）；并且CXCL9的mRNA可在肿瘤组织分选到的白细胞中检测到，而肿瘤细胞没有检测到CXCL9的mRNA（图3F）。与CXCL9和肿瘤浸润淋巴细胞之间的相关性一致，与匹配的大部分新鲜分离外周血标本相比，肿瘤中的CD8+和 CD4+T细胞高表达CXCR3分子（CXC3R是CXCL9的受体）（图3G, 3H）。

因此，Figure3的结论是CXCL9可能与肿瘤中淋巴细胞的募集有关，且CXCL9主要由肿瘤相关巨噬细胞和树突状细胞产生（注意：CCL5主要由肿瘤细胞产生）。其中使用的技术包括免疫组化，多色荧光染色和流式分析技术等。Figure3是因果的相关分析，论证过程全部是实验，难度大（★★★）。

图4A和图4B继续前面的验证，阐释CXCL9是由IFN-γ特异性诱导产生的，而不是像CXCL10那样广谱，为后续研究做好铺垫。