实验专栏丨如何正确选择细胞增殖检测法？

一、Brdu检测法

Brdu检测法的原理：细胞周期的S期，和细胞一起孵育的Brdu能渗入DNA分子中，再结合Brdu抗体与渗入DNA的Brdu特异性结合，就能够检测到DNA复制活跃的细胞。缺点就是比较麻烦，步骤多，中间出问题的环节相应变多，比如固定细胞和核酸变性，受操作和试剂的影响，不同人不同实验室的阳性率及染色的程度都会有所偏差，同时样品形态遭到破坏。

操作步骤：

(1)细胞以1.5×105 /ml细胞数接种于直径35 mm培养皿中(内放置一盖玻片)，培养1d，用含0.4%FBS培养液同步化3d，使绝大多数细胞处于G0期。

(2)加入BrdU(储液：1.0 mg/ml,终浓度为0.03 μg/ml)，37℃，孵育40min。

(3)弃培养液，玻片用PBS洗涤3次。

(4)甲醇/醋酸固定10 min。

(5)经固定的玻片空气干燥，0.3%H2O2-甲醇30 min灭活内源性氧化酶。

(6)5%正常兔血清封闭。

(7)甲酰胺100℃，5 min变性核酸。

(8)冰浴冷却后PBS洗涤，加1抗即抗小鼠BrdU单抗(工作浓度1：50)，阴性对照加PBS或血清。

(9)按ABC法进行检测，苏木素或伊红衬染，在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数，计算标记指数(LI)。

注意事项：

1.BrdU配制方法：10 mg溶于10 ml双蒸水，4℃下避光保存

缺点：

由于抗体分子量大，难于掺入并被有效检测，需要进行DNA变性；

BrdU检测需要孵育BrdU单抗和带标记的二抗，时间长甚至过夜；

BrdU会肌体造成不可逆损伤，使用时注意安全，避免吸入BrdU粉尘。

二、EdU检测

EdU检测原理：EdU(5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷)是一种胸腺嘧啶核苷类似物，在细胞增殖时能够插入正在复制的DNA分子中，与相应的荧光染料反应就可快速的获得有效结果。优点是操作方便，用时少，可与其他染料搭配检测，可在组织器官水平进行检测。

实验步骤：孵育细胞→加入EdU→固定细胞→加染料→荧光检测

优点：与BrdU检测方法相比，EdU：

更快速：只需2.5h，无需抗原抗体反应；

更灵敏：EdU染料只有BrdU抗体的1/500，在细胞内很容易扩散；

更准确：无需DNA变性，能在细胞和组织水平更准确地反映DNA复制活性。

Brdu&EdU

Brdu&EdU均是胸腺嘧啶的衍生物，均可代替胸腺嘧啶在DNA合成期掺入细胞中。

不同的是，Brdu检测法可利用Brdu专一性抗体和其他细胞标记物对细胞进行双重染色，可判断增殖细胞的种类及增殖速度，不仅适用于体外实验也能用于活体实验。这个方法最大的缺点需要变性DNA才能与抗体结合，破坏了DNA双链结构，导致染色弥散、准确性降低等问题。

EdU检测法则基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性，适用于细胞增殖、细胞标记示踪等方面的研究，尤其适合进行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实验。EdU检测染料只有BrdU抗体大小的1/500,在细胞内很容易就扩散，无需DNA变性。

EdU vs BrdU

BrdU与EdU检测优缺点综合比较：

如何正确选择细胞增殖检测法？

那么在这几天分享的几种细胞增殖检测方法中，我们如何选择呢？这主要取决于您的实验目的和细胞类型及数目。

若直接测细胞增殖：可用BrdU或EdU标记法，其中EdU更加快捷准确。

如研究细胞的代谢活性：那么直接选择比色法检测，即MTS、CCK8及SRB法等；

若是高通量的药物筛选：悬浮细胞推荐采用MTS，CCK-8这两种方法，操作较为简单；若是贴壁细胞推荐SRB法，不受时间限制，且有很好的线性关系。

但若药物带有颜色：药物的高通量筛选，且药物处理时间较短，带有颜色，推荐采用基于ATP的检测方法。

细胞类型：如果是悬浮细胞，不适合SRB和MTT，推荐使用MTS和CCK8法。

研究单个细胞：适合选择BrdU或EdU标记法，不适合比色法。

研究少量细胞：如果细胞数少于500，则推荐使用基于ATP的检测方法（ATP检测法明日推送）；

若对细胞增殖及代谢等多个方面感兴趣：可以通过多种方法来验证，如可以选择用BrdU标记，再通过比色法、化学发光或荧光检测进行分析。