美国加州大学团队在AHM|机械-电刺激神经干细胞形成三维自组织神经元-胶质界面

干细胞是一种具有多向分化潜能、自我更新能力的细胞，其中神经干细胞具有发展成为神经元 、星形胶质细胞 和少突胶质细胞 的潜能，关于该细胞的研究对于治疗神经性的疾病，帕金森症，癫痫等具有重要意义。然而，由于基因和代谢方面的差异，目前的动物模型不能准确描述人类神经疾病，体外模型的建立与完善仍然是一个巨大的挑战。近日 ，美国加州大学河滨分校生物工程系的Tai Youyi教授团队在A dvanced Healthcare Materials 发表题为“ Formation of 3D Self-Organized Neuron-Glial Interface Derived from Neural Stem Cells via Mechano-Electrical Stimulation ”的文章。他们设计了一种利用 水声激励电纺压电聚纳米纤维支架压电效应（水声以远程生理安全的方式激活P(VDF-TrFE）支架表面电荷）的技术，证实该装置可以驱动支架表面电荷产生，诱导神经干细胞进行多向分化，且与传统的生物化学介导的分化相比，机电刺激诱导的三维神经元胶质细胞界面增强了细胞成分间相互作用，具有优异的神经连接性和功能性。这种基于功能材料的技术提供了一种新的、有效的患者特异性体外神经模型建立方法，使得神经模型的体外研究成为可能，有望推动体外干细胞的进一步深化研究。

背景介绍

神经干细胞具有发展成为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能，关于该细胞的研究对于治疗神经性的疾病，帕金森症，癫痫等具有重要意义。然而由于基因和代谢方面的差异，目前的动物模型不能复制真实的人类神经疾病。即流行性神经系统疾病/障碍发病机制的基础原理并不清晰，进一步导致无法进行有效的治疗干预。

目前的动物模型受限于神经结构的固有复杂性，即无法用大多数典型的生化/药物试剂实现对神经结构复杂性的构筑，限制了天然组织功能特征的体外模型的开发。而在外源性物理刺激方面已经发现电刺激可以调节神经营养因子促进再生，调节神经干细胞向神经元分化。同时压电材料也以可以提供电刺激贴壁细胞，而不干扰先天电信号转导的优势胜于导电材料。体内研究表明，生物相容性压电聚合物P(VDF-TrFE)导管能够桥接较短的神经间隙，恢复部分功能，但缺乏系统的电压表征和适当活化可能限制了其全部潜力的实现。

该团队认为可以通过水声驱动压电激活支架以生理安全的方式对神经干细胞进行电刺激，并证明，源于压电支架的水-声致动的机电刺激诱导神经干细胞的多表型分化，进一步形成神经元-神经胶质界面，与传统的生物化学介导的分化方案相比，增强了神经功能。机械-电刺激神经干细胞研究提供了一个关键步骤，通过压电材料为基础的平台，对神经细胞进行有效调节，推动体外神经模型的进一步发展。

实验结果

1. 电纺P(VDF-TrFE)纳米纤维的纤维直径的选择

电纺P(VDF-TrFE)纳米纤维的纤维直径决定了其压电性能，因为更小的纤维直径会成倍增加压电常数d33。在实验中选择了静电纺丝制备200nm，500nm，800nm三种直径的均匀排布的纳米纤维进行实验，纳米纤维直径越大，平行排列的程度越大，而不同的三种直径下的纤维排布都在中间轴的20°的范围内（图1 B）。通过使用周期性垂直平移运动水声激励不同尺寸下纳米纤维毡，测得三种纳米直径下的输出电压情况（图1 D），可以观察到输出电压的最大值随着纳米纤维的直径的增加而减小，而随着纳米纤维毡的厚度增加，相同拉伸度下，厚度越大电压值越高。此外，团队评估了纤维直径对mNSCs行为的影响，当静态培养时，相比于200nm直径大小的P(VDF-TrFE)纳米纤维毡，mNSCs在500nm和800nm的纳米纤维毡上的生长表现出更大的排列行为。基于平衡电压性能与观察神经干细胞行为的考虑，之后的研究选择500nm的纳米直径进行。

图1 不同纤维直径电纺取向P(VDF-TrFE)纳米纤维的形态、

压电特性及其对神经干细胞取向的影响

2.  确定控制的应变的大小

为了系统分析设计的体外纤维装置对于细胞的影响，避免水声致动带来压电效应的影响，遂合成得到具有热失活形式的静电纺定取向PVDF纳米纤维。由于TrFE是压电稳定剂，可防止P(VDF-TrFE)中压电性能受到抑制，因此使用与P(VDF-TrFE)具有相似的化学性质但具有独特的压电性能的PVDF。优化静电纺丝参数，制备出与取向P（VDF-TrFE）具有相似纤维直径和取向度的取向PVDF纳米纤维。分别对定取向P(VDF-TrFE)在居里温度(114.9°C)以下、90°C进行促进结晶极化畴的轻微重排的压电增强处理，此时也并不会导致从铁电相到顺电相的完全转变，对PVDF进行不完全熔化纤维结构、钝化压电性能的处理。两种处理的依据分别是图2中的A和B。两种热处理(电纺取向P(VDF-TrFE)纳米纤维为90℃，24小时，电纺取向PVDF纳米纤维为158℃，1小时)对纳米纤维的形态没有影响(图2C，D)。通过压电响应力显微镜(PFM)测量施加不同电压时P(VDF-TrFE)和PVDF的压电系数，得到热处理压电增强前后P(VDF-TrFE)的压电系数分别为-32±3 pmV^-1、-37±4pm V^-1，PVDF热失活后压电系数从处理前d33从-31±8pm V^-1大幅降低至热失活处理后可忽略的-6±2pm V^-1。同时使用水声驱动系统测量两种不同热处理后的纳米纤维垫的电学性能，压电增强的P(VDF-TrFE)输出电压随着施加应变的增加而增加，但压电失活的PVDF在0.03%应变前有着基本不动的电压，之后输出电压随应变增加而增加。

图2 热增强电纺取向P(VDF-TrFE)和热失活电纺取向PVDF支架的压电特性

3.  确定施加的电刺激的大小

为确定增强神经干细胞行为的适当电刺激方案，应用于所有后续研究。对mNSCs施加与来自电支架的水声生成电压相似的外部交流电压脉冲。随电刺激强度从0mV对照组至200mVp-p，mNSCs表现出神经元分化增加，而300mV的高值导致总的mNSCs细胞数目下降，这可能是电刺激造成的损伤引起的。为了平衡低强度电刺激下更高的细胞存活率和较高电输出下所需的神经元分化行为，确定200 mVp-p为最佳刺激方案。

图3 直接电刺激对神经干细胞的影响

4.  电刺激、机械刺激，机械电刺激对mNSCs影响

电刺激(ES:在具有直接电刺激的压电灭活支架上培养的细胞)、机械刺激(MS:在具有水声驱动的压电灭活支架上培养的细胞)或机械电刺激(MES:在具有水声驱动的压电支架上培养的细胞)（机械刺激组与机械电刺激组到底区别在哪，灭活支架如何理解？机械刺激组中的细胞是在压电灭活支架上培养的细胞，机电刺激则是没有灭活的灭活支架鄙人理解是使用在结论二中提到的在热失活的PVDF压电系数基本可以忽略，具有在小于0.03%的形变量时，输出电压不变的性质的纤维支架）对mNSCs朝着神经元、少突胶质细胞或星形胶质细胞分化能力的影响。检测电刺激（ES）、机械刺激（MES）、机械电刺激（MES）、对照组（细胞在组织培养板中静态培养）对神经元、少突胶质细胞或星形胶质细胞的分化能力的影响。通过测定相关的生物因子含量，得到一个如下表1所示的简单图表。  

图4 压电P(VDF-TrFE)支架介导的机电刺激对小鼠神经干细胞多表型分化的影响

5.  机械-电刺激对小鼠神经干细胞（mNSCs）带来的三维生长影响

为了评估工程化神经构建体的形态发育，在压电支架上培养mNSCs或hNSCs3周，同时进行或不进行水声驱动。由于mNSCs的结果与受遗传学强烈影响的人类神经系统疾病的生理学/病理学具有更大的相关性，因此在本研究的其余部分中使用了这些结果来测试其在人类细胞中的再现性。在静态培养条件下，共聚焦三维重建显示细胞主要分化为神经元，这从神经元标志物NeuN的表达以及星形胶质细胞和少突胶质细胞标志物ALDH1L1或O4的缺乏分别可以明显看出（图5A，B）。而机电刺激诱导形成多表型细胞组成的层状结构，NeuN阳性细胞位于细胞顶层，ALDH1L1和O4在支架表面附近细胞表达（图5 D、E和图6 D、E）。星形胶质细胞标记物GFAP和少突胶质细胞标记物O4的表达清楚地显示了机电刺激对胶质细胞表型发育的影响(图5C，F）。从共聚焦z堆获得的单侧斜切片证实了厚度依赖的层状细胞结构，在机械-电条件下由神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的异质群体组成(图5G-L和6G-L)。同时发现，对这些异种细胞群的数量与工程神经结构的厚度定量研究表明，在神经元层下形成了星形细胞和少突胶质细胞的混合物。

图5 压电P(VDF-TrFE)支架介导的机电刺激诱导小鼠神经干细胞

形成三维神经元-胶质界面

6. 机械-电刺激下对神经元和神经胶质细胞之间的细胞相互作用的影响

为了确定机械电刺激神经元和神经胶质细胞之间的细胞相互作用的影响。实验方案如下，通过生物化学介导的生物化学因子或是通过压电支架的水声致动下机械电刺激，对人的神经干细胞（hNSCs）进行三周的分化处理，然后通过共聚焦显微镜对轴突标记物β3-tubulin和髓鞘相关标记物GALC进行仔细检查。人类神经干细胞（hNSCs）在生物化学介导的条件下，出现轴突伸长并产生一些GALC阳性细胞，这说明hNSCs向神经元和少突胶质细胞两种类型分化（图7A-F），但没有观察到神经元与少突胶质细胞的明显的细胞间相互作用。相比于生化介导的情况，机电刺激不仅促进hNSCs同时向神经元和胶质细胞多基因型分化，诱导不同表型间更强的细胞作用，还诱导更多的细胞向少突胶质细胞分化，促进功能成熟。

图6 压电P(VDF-TrFE)支架介导的机电刺激诱导人神经干细胞形成三维神经元-胶质界面

图7 通过压电P(VDF-TrFE)支架介导的机械电刺激原位获得的来自单个神经干细胞源的神经元-神经胶质界面中的细胞-细胞相互作用

7.  使用多电极阵列测量机械-电刺激下各种成分的表达情况

使用多电极阵列（MEA）来测试这种形态学上观察到的、神经元-神经胶质细胞的相互作用，进而观察其是否会影响工程化神经构建体的功能。测试分别在使用生物化学因子(生物化学介导)的MEA阵列的细胞培养室中直接培养的细胞上进行，或是静态培养(静态)或水-声促动(机械-电刺激)后将细胞/压电支架构建体放置在MEA顶部，使细胞面向阵列进行(图8)。对11个随机选择的电极进行单独刺激，并在响应电极中监测动作电位。实验发现，来自压电支架水声激活的机械刺激和电刺激相结合，协同诱导hNSCs同时向所有三种神经细胞类型分化和成熟。更重要的是，在有髓少突胶质细胞存在的情况下，机电刺激促进成熟、细长神经元的产生，从而形成功能胜任的工程化神经组织。即具备更好的连通性（图8A-C），更长的神经突（图8B、C），可能存在的更多的神经元数量（图8D、E），以及可能的更快的反应速度。

图8 多电极阵列对工程神经网络的功能评估样本中

细胞外神经元活性的代表性连接图

总结

综上所述，基于静电纺定取向P(VDF-TrFE)纳米纤维生物相容性压电支架的机电刺激方案已被开发并用于促进NSCs的功能发育。具体而言，利用基于压电材料的技术，通过机械和电刺激的协同影响，实现了NSCs向神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞表型的多表型分化的显著增强。不同细胞群之间的细胞相互作用导致了具有组织化三维结构的优越神经功能。这些结果证明了基于压电材料的技术，在由具有良好组织功能的、多种细胞表型组成的患者干细胞来源性神经组织中形成的应用潜力。

参考文献

Tai, YouyiIco, GerardoLow, KarenLiu, Junze Jariwala, TanviGarcia-Viramontes, David Lee, Kyu Hwan Myung, Nosang VPark, B HyleNam, Jin，2021. Formation of 3D Self-Organized Neuron-Glial Interface Derived from NeuralStem Cells via Mechano-Electrical Stimulation, Advanced Healthcare Materials:2100806

DOI 10.1002/adhm.202100806