基因敲除鼠技术系列之五：诱导型条件性基因敲除

诱导型条件性基因敲除

一、条件性基因敲除技术

条件性基因敲除，指在小鼠发育的特定阶段或特定细胞组织类型中将目的基因进行敲除。条件性基因敲除技术的本质是基于常规基因敲除技术，通过重组酶Cre对靶位点进行特异性重组，可以对小鼠的基因组修饰进行时间和空间上的调控[文献1 参考文献]。

二、条件性基因敲除小鼠

Cre重组酶的条件性表达（时间或空间控制）使得能够保证在特定部位（例如在特定细胞类型或组织中）以及特定时间（在小鼠细胞及组织发育的特定阶段）删除DNA序列[1]。

对于条件位点特异性的基因组修饰通常需要两种小鼠：

• 第一种是flox（flanked by loxP）小鼠，将具有目的DNA序列的小鼠侧翼插入LoxP位点[1]。flox小鼠一般要通过设计构建打靶载体、胚胎干细胞重组、囊胚显微注射、嵌合体小鼠传代来获得。
• 第二种是Cre重组酶转基因小鼠，将Cre重组酶cDNA通过基因工程的手段置于组织或细胞特异性启动子之下[2]。Cre重组酶在启动子的控制下瞬时表达，这些启动子仅在特定细胞类型或组织中表达活性，或在细胞及组织的特定发育阶段具有活性[1]。

当使用Cre转基因小鼠与flox小鼠交配之后，可以得到条件性基因敲除小鼠[2]。插入flox的DNA序列在表达Cre的特定细胞类型或组织中被删除[1]。

三、诱导型条件性基因敲除

某些启动子（即诱导型启动子）也可以受某些外源性化学物质的调控，外源性调控的基因敲除可以避免在胚胎发育早期由于基因功能的异常所产生的副作用[3]。常见的几种诱导型类型如下：四环素诱导型；干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型[4]。这其中最频繁使用的是四环素系统（Tet-Off System/Tet-On System）和他莫昔芬系统（Tamoxifen System）[3]。

1、他莫昔芬系统（Tamoxifen System）

将雌激素受体（ER）的配体结合域（ligand binding domain，LBD）与Cre重组酶相融合，形成定位于胞浆中的融合蛋白（Cre-ER）。由于机体自身分泌雌激素，因此为了避免内源雌激素的干扰，对人雌激素受体的配体结合域进行一个点突变（G521R）。突变后的雌激素受体不再与它的天然配体（17β-雌二醇）结合，而只与合成配体结合，如他莫昔芬（Tamoxifen）、4-羟基他莫昔芬（4-OHT），因此被命名为Cre-ERT。另一种LBD突变体融合蛋白带有3个点突变（C400V/M543A/L544A），被证明对4-OHT具有远高于Cre-ERT的敏感性，被命名为Cre-ERT2。Cre-ER系统，特别是Cre-ERT2，是目前应用最广泛的诱导型Cre系统。只需要将Cre-ERT2设计在组织特异性启动子之后，并与flox小鼠交配，就可以通过在特定时间点给予Tamoxifen来最终实现对靶基因的时空特异性敲除[5]。

Tamoxifen作用[3]：

• 不加Tamoxifen时，Cre-ERT融合蛋白分布于细胞质中并结合热激蛋白（如Hsp90），抑制受体临近结构域的功能，使这种复合体定位于细胞质中，而不能进入核。
• 加入Tamoxifen时，Hsp90从ER中转移出来，ER转变为活性状态，暴露出ER的核定位信号，在核定位信号的引导下，Cre重组酶能进入核中并行使其功能。

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参考文献

[1]王超玄,孙航.基因敲除小鼠技术的研究进展[J].生物工程学报,2019,35(05):784-794.

[2]条件性基因敲除的原理和设计原则. https://www.docin.com/p-434110313.html

[3]【干货】诱导型条件性基因敲除介绍. http://www.360doc.com/content/19/1103/22/66913840_870923042.shtml

[4]百度百科_基因敲除技术. https://baike.baidu.com/item/ 基因敲除技术

[5]「精华」诱导型 Cre，给基因敲除装个「开关」. http://commercial.dxy.cn/article/555344