干货┃外泌体蛋白组学之纯化篇

外泌体能传递生物信息通过多种方式对细胞的生理活动进行调节并与多种疾病的发生发展密切相关因此成为近年来研究的一大热点。外泌体分布广泛，几乎存在于人体所有体液和细胞培养液中且易无创获取，作为肿瘤标志物可用于肿瘤的诊断进展及预后评估还可作为纳米载体装载基因或药物到达靶器官在临床治疗中有较好的应用前景。

外泌体中蛋白质是参与疾病发生、发展的重要部分。经质谱鉴定发现不同来源外泌体携带了4400余种特异性蛋白质。而蛋白质差异表达是区分不同来源外泌体的重要特点也是研究外泌体的重要途径。然而与核酸相比,外泌体蛋白质的差异表达更难被检测出来,并且常规的分离方法极易携带蛋白质污染,是外泌体蛋白质研究主要面临的难题,也限制了蛋白质研究的发展。但是,随着蛋白质组学技术的快速更新,外泌体特异蛋白质的研究将具有巨大的前景。

外泌体的分离和纯化是外泌体蛋白质组学研究的前提。而目前的外泌体提取方法多样且没有形成统一的标准。本文就常见外泌体提取方法的研究进展作一简述以供参考。

外泌体的提取方法包括差速超速离心法、密度梯度离心法、试剂盒法等，每种方法各有其优缺点，方不同对所提纯的外泌体大小，形态，密集程度等有所影响 。

超速离心法：

超速离心分离外泌体是目前使用最为广泛的一种方法，也是目前公认的金标准。其原理是根据外泌体与细胞不同组分的沉降系数不同，利用不同强度离心力使样品中死亡细胞、细胞碎片、细胞器等组分被分离出去，然后获得外泌体及部分受到污染的蛋白，用PBS再次重悬清洗离心后即可获得实验所需外泌体。超速离心的优点是能够大量处理样本，且与其他方法相比提取的外泌体形态及后续的外泌体鉴定与经典文献描述相似，因此是目前公认的提取外泌体最有效可靠的方法。

CNS级的文章中超速离心法提取外泌体可谓不胜枚举！

举几个例子：

1200g离心去除死细胞，然后将上清用琼脂糖凝胶过滤，接着100000g高速离心获得外泌体（外泌体来源：羊网织红细胞）

Pan BT, Johnstone RM. Fate of the transferrin receptor during maturation of sheep reticulocytes in vitro: selective externalization of the receptor. Cell. 1983;33(3):967-78

本文提取了MDA-MB231乳腺癌细胞分泌的外泌体,方法是将分离的细胞悬液500g离心10min去除细胞，12000g离心20min去除细胞碎片，100000g离心70分钟，用PBS重悬清洗后重复离心后获得。

Hoshino A, Costa-Silva B, Shen TL, et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 2015;527(7578):329-35

本文将脂肪组织切碎用PBS和EDTA重悬后600g离心5min去除残余组织和细胞，然后将上清转到30ml离心管中1200g离心15min，取上清10000g离心15min，再把上清用0.22μm过滤器过滤除去大膜泡和细胞碎片，最后100000g离心1.5h获得外泌体。

Crewe C,Joffin N, Rutkowski JM, Kim M, Zhang F, Towler DA, Gordillo R, Scherer PE. An Endothelial-to-Adipocyte Extracellular Vesicle Axis Governed by Metabolic State. Cell. 2018 Oct 3. pii: S0092-8674(18)31177-2. doi:10.1016/j.cell.2018.09.005.

密度梯度离心法：密度梯度离心是在离心管中形成特定密度梯度介质（如目前常用的蔗糖和碘克沙醇），通常离心管管底的密度最大，向上逐渐减小。将待分离的样品平铺在梯度顶端，不同密度的颗粒组分在一定的离心力作用下使密度小者上浮，密度大者下沉，最终不同密度的颗粒会停滞在相应等密度区。如蔗糖密度梯度离心是将蔗糖溶液浓度设置在22.8%～60%W/W，富集的外泌体密度为1.13-119g/ml。蔗该方法提取的外泌体纯度高，已有报道该方法提取的外泌体作为药物载体用于临床试验。但是该方法前期准备工作繁杂，耗时长，得率低。

本文使用10%-30%苯氧乙基青霉素钾密度梯度离心后取每个组分进一步分析（共培养细胞上清液25万g离心18h）

Regev-Rudzki N, Wilson DW, Carvalho TG, et al. Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles. Cell. 2013;153(5):1120-33

本文首先300g离心5min分离了果蝇胚胎细胞S2培养上清，接着将上清液2000g离心10min去除死细胞。10000g离心30min去除细胞碎片，10万g离心70min初步获得外泌体，用PBS重悬外泌体后加入到tris-蔗糖-重水混合密度梯度溶液中继续10万g离心75min，用注射器吸取tris-蔗糖界面的外泌体，最后为了去除样品中的重水和蔗糖，加入60mlPBS继续10万g离心70分钟最终获得高纯度外泌体。

Ashley J, Cordy B, Lucia D, Fradkin LG, Budnik V, Thomson T. Retrovirus-like Gag Protein Arc1 Binds RNA and Traffics across Synaptic Boutons. Cell. 2018;172(1-2):262-274.

分子排阻色谱法（SEC）：又叫凝胶过滤层析法，主要根据样品颗粒体积大小进行分离纯化。凝胶过滤所用的介质是凝胶珠（分离外泌体的beads孔径一般为75nm），其内部是多孔网状结构。当样品颗粒进入凝胶层析柱时，体积大于凝胶孔孔径的颗粒不能进入凝胶珠中而被排阻在凝胶颗粒外，沿着凝胶间的空隙流过凝胶柱，这部分颗粒由于保留时间短，最先被洗脱下来。而蛋白等成分会滞留在凝胶孔，被洗脱下来的时间会滞后。SEC法提取的外泌体纯度高，重复性好，但是需要特殊设备，且实验过程中需要摸索介质类型、孔径大小、柱体积、流速等因素，因此该方法目前比较少用。

本文在10ml注射器中用CL-2B琼脂糖填满，形成一个分子筛装置，接着将无血小板的上清液加入到注射器中然后收集每个组分用于后续的外泌体表征。

Böing AN, van der Pol E, Grootemaat AE, Coumans FA, Sturk A, Nieuwland R. Single-Step Isolation of Extracellular Vesicles By Size-Exclusion Chromatography. J. Extracell. Vesicles.2014; 3:23430.

本文对比使用了三种方法SEC、PEG沉淀、丙酮沉淀（PROSPR）分别分离血浆外泌体，发现SEC分离的外泌体颗粒为80-200nm，PEG沉淀几乎没有扫描到外泌体，丙酮沉淀得到的囊泡大小在300-500nm。

Gámez-Valero A, Monguió-Tortajada M, Carreras-Planella L, Franquesa M, Beyer K, Borràs FE.Size-Exclusion Chromatography-Based Isolation Minimally Alters Extracellular Vesicles’ Characteristics Compared to Precipitating Agents. Sci. Rep. 2016; 6:33641.

试剂盒法：目前最常用的是ExoQuick试剂盒通过聚合物共沉淀剂ExoQuick预混液与样本４℃共孵育使外泌体聚集第二天1500g离心5min，PBS重悬沉淀即可获得外泌体。此法仅需简单混匀和常规离心即可从少量样本中获得丰富的外泌体简便快捷设备要求低。但沉淀中也含有其他囊泡及大分子杂质蛋白影响外泌体纯度，也有报道提出该法影响外泌体蛋白和miRNA组分不利于后续蛋白组学和遗传学研究。

本文作者分离人血清外泌体使用三种不同的提取外泌体的试剂盒（TEIR、ExoQuick、miRCURY）与超速离心做对比发现超速离心获得的外泌体直径大于试剂盒获得的外泌体，但是得率没有试剂盒多。

Acomparativestudyof serum exosome isolationusing differential ultracentrifugationand three commercial reagents［J］．HelwaI，Cai J，DrewryMD，et al．PLoSOne，2017，12( 1) :e0170628．

免疫磁珠法：免疫磁珠法是将磁珠表面包被外泌体marker抗体如CD9、CD63、CD81的抗体，再与外泌体样本孵育，混合旋转并与4℃过夜，次日离心后去除上清液，加入分离缓冲液反复冲洗。如此获得的外泌体形态完整，特异性较高。但是由于不同来源的外泌体样本表达的特异性蛋白不同，所以该方法不能适用与所有外泌体的提取，此外洗脱环境pH及盐浓度会破坏外泌体的生物活性。

本文使用ProteinG的磁珠beads结合CD63的抗体形成抗体复合物beads然后跟乳腺癌细胞分泌的外泌体样品进行孵育过夜然后将离心管放置在一个磁力板上使磁珠吸到管底，去除上清后再通过洗脱buffer洗脱磁珠上的外泌体。

HannafonBN，Trigoso YD，Calloway CL，et al． Plasma exosome microＲNAs are indicative of breast cancer［J］． Breast CancerＲesearchBcr，2016，18( 1) :90

超滤法：超滤法是将溶剂及小分子物质过滤到膜的另一侧而将相对大分子物质截留在超滤膜上以达到分离的目的。用孔径小于100nm的超滤膜短时间低速离心就可以分离样本中的外泌体。目前超滤法分压力超滤和离心超滤两种一般认为离心法较优。通常离心力越高离心时间越长所得外泌体的浓度越高但离心力太大离心时间太长又会导致超滤膜破裂，因此适度的离心力和时间对于分离成功很重要。也有研究提出50-200ml样本更适合采用离心法而样本量大于400ml时适合用压力法。超滤法操作简单对样本体积要求低只需低速离心能大大减少超高速引起的外泌体破裂 但该法需要考虑膜的孔径范围外泌体和大分子蛋白质可能粘附堵塞滤孔影响外泌体提取率和纯度。

本文分离人尿液中外泌体，先将尿液2500g离心15min去除细菌和死细胞碎片，接着用0.1μm过滤器过滤，获得的过滤液再用超滤管3200g超滤（10Kd）获得外泌体。

Merchant ML, Powell DW, Wilkey DWet al.Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by MS.Proteomics Clin Appl 2010;4: 84–96