干货 | 外泌体蛋白组学之数据结果篇

外泌体蛋白作为近年来愈研愈烈的热点，日常简单的蛋白质研究方法学Western Blot等已经不能满足全方位研究外泌体蛋白的需求；蛋白质组学作为一种全方位研究蛋白质的方法，将其和外泌体研究结合起来，那么外泌体之火必然照亮整个科研世界。 

北京青莲百奥生物科技有限公司作为发扬蛋白质组学技术为己任的公司，青莲百奥有能力也有实力承接各种蛋白质组学包括外泌体在内的高难度的项目。下面以外泌体项目为例，微微展示一下我们的数据。

在之前的外泌体专题中（干货┃外泌体蛋白组学之纯化篇；干货 | 外泌体蛋白质组学之流程篇）已经介绍了国际上较为前沿各种纯化外泌体方法以及本公司的所采用的外泌体蛋白质组学的整体方案流程（包括分离），本期小编主要带大家一起来看一下怎样去评价分离后的外泌体以及进行蛋白质组学分析后会拿到怎样的数据，最后又是怎样分析这些数据的。

1.外泌体的评价

只要看过外泌体相关文献就会发现外泌体分离效果的评价至关重要，那么，问题来了，外泌体的评价都有哪些方法呢，每种方法都是必要的吗？一般来说电镜图和WB是必须有的，最好再配一个粒径分析：电镜扫描观察外泌体的形态结构；纳米颗粒追踪分析技术( nanoparticle tracking analysis，NTA)检测外泌体 大 小 及 数 量；蛋白免疫印迹法分析外泌体表面蛋白。

NAT评价

纳米颗粒跟踪分析技术（Nanoparticle Tracking Analysis，NTA），是近年来新兴的纳米级别测量技术之一，原理是纳米颗粒在其悬浊液中受到周边溶液分子的撞击而做无规则的布朗运动，然后通过斯托克斯-爱因斯坦方程，这些颗粒在单位时间内 (ts) 的移动速度（<x,y>2）与其本身的粒度（dh）、溶液的粘度（Ƞ）和温度（T）存在数量上的关系。因此通过观察溶液中的外泌体运动轨迹，得出与之相关的外泌体粒径数据。同时，通过仪器内置的高速相机和软件，对观察到的每一个颗粒进行跟踪分析，最终提供与常规粒度仪所不同的外泌体数量及浓度分布，电荷图案等外泌体表征。

电镜评价

细胞上清来源外泌体大小在20-200nm之间，绝大多数球状或杯状或茶托样结构， 形态完整，虽然电镜质量的好坏也会影响最终鉴定的结果，但是一个操作失败的提取方法提取出来的外泌体用什么样的电镜都不可能拍出好看的图片的，所以成功的提取过程显得更为重要。

Western Blot

基于外泌体特异性标志物可以利用Western blot进行检测特异性抗体的表达强弱进行评价，那么外泌体蛋白进行WB鉴定时通常会检测哪些蛋白呢，根据多数文献报道，排在前几位的检测指标为CD63、Tsg101、CD9、CD81等，也有少数文献报道用Alix、HSP70、HSPA8、 Syntenin、ADAM10等，我们可以根据客户的不同需要进行选择相应抗体进行鉴定。

2.不同样本外泌体蛋白数据量

人体内多种细胞均可分泌外泌体，包括内皮细胞、免疫细胞、血小板、平滑肌细胞等，并且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。而不同细胞或样本中所含外泌体的总量也是有所不同的，下面就介绍一下我们常见的样本中外泌体组学所能得到的蛋白数据量。

血清样本

以我们最近所接到的项目为例的话，用超速离心法提取血清外泌体，最终得到样品不分馏分（即一个馏分）直接上机检测，可以检测到接近400个蛋白表达谱，且90%以上的蛋白都能够被注释到外泌体蛋白库中。

需要提的是血清样本适当增加馏分可以大大提高低丰度蛋白的检出率，比如另外一项目2mL血液提取外泌体后，分成8个馏分上机，可以将测到近800个蛋白表达谱。

尿液样本

将尿液分成3个馏分上机可以检测到近1000个蛋白表达谱，90%以上蛋白注释到外泌体蛋白库是没有问题的。

细胞样本

不同的细胞分泌的蛋白数目是有所区别的，把样品交给我们各中细胞外泌体的检出率是有保障的。

3.生物信息分析

生物信息学（Bioinformatics）是在生命科学的研究中，以计算机为工具对生物信息进行储存、检索和分析的科学。它是当今生命科学和自然科学的重大前沿领域之一，同时也将是21世纪自然科学的核心领域之一。在分析过程主要使用了信息学的技术，这包括了从应用数学、计算机科学以及统计学等学科衍生而来各种方法，并以此在大尺度上来理解和组织或生物大分子与生物大分子相关的信息，例如整体分析、差异分析、蛋白质互作等，当然青莲百奥公司也为大家做了部分免费的生信分析，下面以某项目人的样本为例看一下我们为大家做的生信分析结果。

Heat map

聚类分析是模式识别和数据挖掘中普遍使用的一种方法，是基于数据的知识发现的有效方法。聚类分析不需要任何先验领域知识，它根据数学特征提取分类标准，对数据进行分类，发现对象之间的相似度。我们利用多样品间表达模式聚类分析观察不同蛋白在不同样品间比较时的上调、下调情况。使用最短的枝干将数据进行连接，欧氏距离较近说明两组数据性质较近，距离较远说明为关联较远。所以我们进行聚类作图从而观察数据相近程度。取蛋白质搜库结果蛋白质列表去除为零的数据，以此为基础进行聚类分析，以及后续的差异蛋白的筛选、火山图的制作等。

主成分分析（Principal Component Analysis, PCA） 

通过正交变换将一组可能存在相关性的变量转换为一组线性不相关的变量，转换后的这组变量叫主成分。对于表达数据而言，则是设法将所有蛋白依据其表达量关系重新组合成一组新的互不相关的几个综合变量，同时根据实际需要从中取出少数几个综合变量以尽可能多地反映原来变量的信息的统计方法叫做主成分分析，也是数学上用来降维的一种方法。该方法可以反应在降维后的少数几个主成分对样品的区分情况。主成分分析图横纵坐标分别为前两个主成分，括号内的百分比为该主成分能解释的变量的百分比（也即能解释的蛋白数量的百分比）。

GO分析 Gene Ontology（简称GO）

GO分析是生物信息领域中一个极为重要的方法和工具，通过建立一套具有动态形式的控制字集（controlled vocabulary），来解释真核基因及蛋白质在细胞内所扮演的角色，从而来全面描述生物体中基因和基因产物的属性。GO总共有三个本体（Ontology），分别描述基因的分子功能（Molecular Function）、所处的细胞位置（Cellular Component）、参与的生物过程（Biological Process）。

通路注释 pathway Pathway

通路注释显著性富集分析方法同GO功能富集分析，是以 KEGG Pathway为单位，应用超几何检验，找出与所有鉴定到蛋白背景相比，在差异蛋白中显著性富集的Pathway。通过Pathway显著性富集能确定差异蛋白参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。

蛋白质相互作用 

随着生命科学研究的不断发展，人们逐渐意识到基因组信息已经不能完全解释和预测各种生命过程及现象，而蛋白质作为细胞活性和功能的执行者，越来越受到人们的关注。然而，蛋白质功能的发挥不是凭借单个蛋白质独立执行，而是依靠蛋白质与蛋白质相互作用(Protein protein interaction, PPI)执行其功能。因此，蛋白质相互作用出现异常将会影响细胞活性和功能的发挥。