C57小鼠脾脏单细胞悬液制备

我是按如下步骤操作的：

（1）颈椎脱臼法处死小鼠，分离脾脏

（2）超净台内无菌条件下将脾脏放入提前准备好的培养皿中，其内有预冷的PBS，简单冲洗，分离多余组织及包膜

（3）将其放入装有3ml 1640培养基/PBS缓冲液的培养皿中，其内预先铺有200目尼龙滤网，用注射器胶塞轻轻研磨，将过滤的细胞悬液吸入离心管（15ml/5ml离心管）

（4）再用3ml无菌PBS冲洗滤网后一并吸入离心管，收集细胞悬浮液约6-10ml,300g/1500 rpm离心5min，弃上清

（5）加入3ml红细胞裂解液（约占细胞悬液的3-5倍），混匀后冰上裂解5min，再加入5ml PBS终止裂解，300g/1500 rpm离心5min，弃上清

（6）加入1ml PBS 洗涤一遍，300g/1500 rpm离心5min，弃上清

（7）1ml无菌PBS重悬细胞，200目尼龙滤网过滤，即为制备好的脾脏单细胞悬液。

但是最终细胞计数出来死了98%，只有2%的活细胞，全程都是无菌操作，PBS都是预冷的，不知道问题出在哪儿，求大神指点！！！