实习笔记 || 从实验到实战，ElISA十天所获所得，还有诸多疑惑，期待一起讨论

一、我用ELISA做过的项目及其方法

科室一共有三台全自动酶免分析仪，下面的1.2.3.是根据不同仪器做的项目分的类。

1.肿瘤标志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、EB病毒VCA—IgA）

AFP、CEA用的双抗体夹心，EB病毒VCA-IgA用的间接法

2.乙肝两对半定性

HBsAg 双抗体夹心法

HBsAb 双抗原夹心法

HBeAg 双抗体夹心法

HBeAb 竞争抑制法

HBcAb 竞争抑制法

3.甲、丙、戊肝炎病毒抗体，HIV抗体，EB Rta IgG

甲、戊肝病毒抗体测的都是IgM，所以用的捕获法

HCV IgG 间接法

HIV抗体 双抗原夹心法

EB Rta IgG用的间接法

二、方法学选择

理论课本上ELISA的方法有四种：夹心法、间接法（第二抗体那种）、捕获法、竞争法

受抗原抗体间结合力、抗原抗体反应空间位阻、酶标记物制作和固相包被的可行性以及便捷度等因素影响，针对不同检测项目，选用不同的方法。只要能把握住抗原抗体反应的特异性和比例性，保证抗原抗体最佳反应，得出能够满足临床检验需求的最佳结果。

1.夹心法很费抗原抗体，特异性最好。

常用来检测抗原，大概是抗体特殊的空间构象比较容易标记，或者抗体更容易制备、纯化吧。

但是要注意一步法，抗原过量导致的钩状效应。（两对半的时候，只有HBsAg用的两步法，加标本后需要温浴，其他就接着加酶标试剂了，加完一起温浴的。HBcAb虽然用的一步法，但它是稀释30倍以后再测的。）

2.间接法常用于检查抗体，理论上，只需要换一下板就能检查另一个项目，很方便工厂生产试剂。酶标第二抗体的特异性又没那么强，如果标本加上去之后洗板没洗好，未结合的游离抗体没洗掉，那结果就很不好看。（我臆测的）

3.捕获法主要用于血清中某种抗体亚型的检测，常用于测IgM

板上预包被抗人IgM（抗u链），然后再加标本温浴捕获标本里的IgM，再加抗原与酶标抗体，以IgM形成双抗体夹心。

4.竞争法结果分析的时候脑子需要绕个弯，但竞争法很省抗原抗体，并且竞争法可测半抗原（只有免疫反应性，无免疫原性。可与相应抗体发生特异性结合，但单独不能诱导免疫应答，多半是多糖类。相对分子质量小(通常小于l万)，且只带一个抗原决定簇，连接到大分子载体可成为完全抗原。）

三、相关知识链接

各型肝炎病毒及相应肝炎的特点

四、结果

我不太晓得CUT—OFF值是怎么得到的，几个项目的算法不太一样，统计学拟合出来的嘛？

五、结果分析

全自动酶免分析仪，是个好东西，通量很大，一个人就能操作三台机器，大大解放了手工，提高了效率。

但是过程很长，步骤很多，有众多影响因素，试剂有效性、样品是否污染、有没有加到样、加样是否足量、温控孵育是否正常、洗板是否正常等等（人、机、料、法、环，整个检测系统都会影响结果，所以整个全自动过程都需要人在旁边看着点）

做出的结果，能得出临界值，根据临界值可判断阴阳性。但临界值是临界值，医学决定水平是医学决定水平，阳性不一定有病，阴性不一定没病。如果结果存疑，我们通常会用其他方法做一下验证，胶体金和发光。

比较一下，发光灵敏度挺高的，胶体金灵敏度太低了，但操作很是方便，用时也短。

六、注意事项

试剂很多，很容易搞混，加之前，看清楚。

用前检查试剂的有效期和批号

溶血、脂血、黄疸标本可能会影响比色，提前标记好。

仪器自动加样的时候看着点，真的发生过没加上的情况

试剂盒都平衡到室温再用，给抗原抗体反应提供最适宜的条件。

把握好每天的标本量和试剂消耗量，每天的试剂最好都换一换，尤其是酶，一冷一热，真的很影响活性。虽然课本上讲，高温使酶失活，低温抑制酶的活性。

其他试剂也是会脏的。终止液里的絮状杂质真是惊到我了。

七、临床意义

1.肿瘤标志物不具备诊断价值，用于辅助诊断、预后评估和治疗效果检测。

2.乙肝两对半中，

①HBsAg是病毒糖蛋白外壳的一部分，由乙肝病毒S开放阅读框编码形成。有小蛋白、中蛋白 和大蛋白三种形式。小蛋白与乙肝病毒进入肝细胞并脱去外壳过程相关；中蛋白比小蛋白多一段前S2编码的氨基酸序列，使乙肝病毒与肝细胞白蛋白结合；大蛋白比小蛋白多前S1、S2编码的氨基酸序列，使乙肝病毒与肝细胞结合。

HBsAg代表着乙肝病毒感染，但慢性HBV感染，由于HBsAg低水平表达，血清中不一定能检出。暴发性肝炎也可因为早期迅速出现强免疫应答，也不易检出。（暴发型肝炎或称急性重型肝炎很少见，起病急骤，病程短，大多为 10 天左右， 以肝细胞严重而广泛坏死为特征，病变严重，死亡率高）

②得益于乙肝疫苗的接种，见过最多的结果就是只有HBsAb阳性

我们打的乙肝疫苗是灭活的纯化的乙肝病毒球形颗粒（HBsAg），不含有病毒核心成分，不具感染性，只有病毒核衣壳，所以只诱导产生HBsAb这种保护性抗体。

③HBeAg提示完整病毒颗粒存在，代表乙肝病毒正在活跃复制中，传染性很强，其量与病毒复制呈正相关性。

HBV 的核衣壳有“核心蛋白”（乙型肝炎核心抗原， HBcAg); 在核心区还有一多肽转录物 (HBeAg) 。不同的是，HBcAg 在感染的肝细胞内，而 HBeAg 则分泌到血液中 。

④

⑤HBcAb大多数情况表示感染过。

HBcAb具有出现早、效价高、持续存在的特点。高滴度阳性提示病毒复制活动性感染，低滴度提示以往感染。

3.两对半各类模式

明白肝炎病毒的结构、基因及其编码的抗原、再对应着产生哪些抗体，明白两对半各项的来龙去脉，分辨在窗口期、早期、活动期、恢复期、既往感染中的同与不同，知道怎么分析结果就行，不用死记硬背。

相关名词

携带者状态 (carrier state) 无明显症状或仅有轻微临床表现的慢性病毒性肝炎，患者呈现病毒抗原阳性，但无明显的肝损。

感染的肝细胞表面可分泌大量HBsAg，使机体免疫系统，尤其是CD8阳性T细胞识别并杀伤感染细胞，导致肝细胞坏死或者凋亡。在机体缺乏有效的免疫反应的情况下则表现为携带者状态。

4.甲肝IgM抗体出现在原发性感染早期，通常在血清中持续大约3个月左右。阳性结果表示近期感染。

5.戊肝抗体属于保护性抗体。

6.HIV抗体的检测，临床实验室进行的只是筛查实验，诊断实验和确认实验还需要CDC做。