【总结】一些关于 293T 细胞的培养

包装细胞 293T 细胞的培养

一、293T 细胞的冻存

1. 随着传代的次数增加，293T 细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。

2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。

3. 倒去细胞上清液，加入 D-Hank's 液洗去残留的培养基。

4. 加入 0.25% 的胰酶，消化 10-20s 后倒去。

5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。

6. 细胞计数。

7. 将细胞离心，1000rpm，2min。

8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70% 完全培养基 + 20% FBS + 10% DMSO）重悬细胞，密度为 3×106 个 /ml。

9. 分装进细胞冻存管，放入泡沫盒中，放入 - 80℃超低温冰箱。

10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。

11. 复苏检测细胞存活率，细胞状态等，并记录。

二. 293T 细胞的传代

1. 当细胞生长至汇合率达到 80~90% 需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。

2. 消化细胞，方法同上。

3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为 3×105 个 /ml。

4. 分到 10cm 培养皿中，10ml / 皿。

5. 放回 37℃、3% CO2 和 95% 相对湿度的培养箱中培养。

三. 293T 细胞的复苏

1. 当细胞传代次数过多（超过 50 代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。

2. 打开水浴锅，设置温度为 40℃。

3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在 1~2 min 内使细胞溶液完全溶解。

4. 将 1ml 细胞溶液加入 9 ml 完全培养基中并混匀后转入 10cm 培养皿。

5. 放回 37℃、3% CO2 和 95% 相对湿度的培养箱中培养。

6. 第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入 10ml 新鲜培养基。

用于包装的 293T 细胞的培养

用于包装的 293T 细胞 (ATCC No. CRL-11268) 必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率 90% 以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。任何时候细胞汇合率都不准达到 100%。

慢病毒的包装

1. 预先准备 3 个 T150 瓶的 293T 细胞，培养基为 DMEM + 10% FBS，1% Glutamax ，1% 青霉素 - 链霉素。

2. 将细胞分到 12 分到 12 个 T150 瓶中，每瓶的细胞密度是 8×106 个。

3. 第二天，镜下检查细胞。细胞融合度应大致为 30-40%，分布均匀。

4. 转染前 1 小时，取出细胞板，去除原有细胞培养基，加入 20ml 的 Opti-MEM 培养基，将细胞送回培养箱。

5. 取两支无菌的 50ml 离心管，其中一支中加入 252 μg pNL-EGFP/CMV/WPREDU3 载体质粒，168 μg pCD/NL-BH*DDD 包装质粒和 84 μg pLTR-G 质粒，用 Opti-MEM 培养基补齐到 18ml。另一支中加入 500 µl Trans-EZ 溶液和 17.5 ml Opti-MEM 培养基，用电动移液器轻轻混匀。将 Trans-EZ 稀释液滴加到质粒管中，边加边轻轻晃匀。

关键步骤：推荐使用 Qiagen 质粒大抽试剂盒或相当的试剂盒所制备的质粒。

6. 室温孵育 20 分钟，使 DNA 和 Trans-EZ 充分结合形成转染复合体。

7. 取 1 支 5ml 的移液管，将得到的 DNA-Trans-EZ 复合体均匀滴加入到细胞培养板中，每板 3ml。来回晃动培养板，混匀后放回到 5% 二氧化碳培养箱。每一皿细胞培养盘不要超过 6 盘。

8. 6 小时后，移去细胞上清，更换为 17ml 的 DMEM 完全培养基。

9. 转染后一天观察细胞，所有的细胞应当都是健康的并且密度接近 60-80%。如果所转染质粒带有 GFP 荧光，那么这时候可以看到大于 95% 的细胞都是带有荧光的。

10. 将细胞送回培养箱继续培养 2 天（36-48 小时）。在这个过程中，细胞会逐渐融合形成多核体，大多数的细胞依然贴壁。

11. 收集所有的上清，分装到 50ml 离心管中。

12 .4℃，500g 离心 10 分钟，除去脱落的细胞和大的细胞碎片。

13. 总的上清约为 204 ml，用 250-ml 0.45 μm PVDF 过滤装置过滤。如果发现滤膜被堵住，表现为过滤速度变慢，更换新的滤器。

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