原代血管平滑肌细胞的提取与培养

采用组织贴块法提取原代血管平滑肌细胞（VSMCs），150gSD大鼠，麻醉致死后放入75%乙醇中3min,开胸后取胸主动脉置于预冷的DMEM培基中，3只大鼠动脉取完后转至超净台，在培养皿中加入PBS，去除外层结缔组织和血细胞，然后沿动脉长轴剪开，弯镊轻刮内膜2-3次，然后用弯镊钝端压至中膜出现裂口，向下推中膜，使中膜和外膜分离，由于技术问题，分得的中膜为非连续小段，然后将中膜转至另一培养皿中剪成小块，用枪头将组织块转移至培养瓶中，然后将组织块分散铺开，培养瓶倒置，加入5ml含20%血清的DMEM高糖培基，待三条动脉处理完后，一同放入培养箱中，3小时后翻转瓶身（因为上次提原代时倒置2h后仍有组织漂起，所以延长了1h)，组织块贴壁良好，绝对静置3天后更换培基，其后每3天换液一次，每天均有将培养瓶拿出于显微镜下观察，目前11天了还没有细胞爬出。

考虑因素：①从取材至放入培养箱时间过长，3只大鼠花费2个小时，影响组织活性？

②组织干涸过久影响组织活性？组织剪碎转移至培养瓶中时感觉开始趋于干涸状态，未见明显液体，但置于培养箱后3h翻瓶是否组织活性已受损？

③观察太频繁影响细胞爬出？提取原代过程中是不是不能每天都观察？

④取中膜时对中膜推挤过多导致组织活性损伤？

⑤组织块剪碎时边缘不齐影响细胞爬出？剪碎组织时最好用弯剪？

请问有养原代血管平滑肌细胞的大佬可以指导一下吗，然后请问大家的VSMCs状态好时生长速度和细胞铺板后贴壁时间以及贴壁率大概是什么样的呢？我上次提的那批铺板后24小时还有一半细胞漂着，大家有什么指导建议吗，感谢