实验室祖传的常见组织细胞培养方法

体内组织细胞在体外培养时，所需培养环境基本相似，但由于物种、个体遗传背景及所处发育阶段等的不同，各自要求条件有一定差别，所采取的培养技术措施亦不尽相同，现介绍个别组织细胞培养的要点如下：

第一节 上皮细胞培养

上皮细胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮组织，故上皮细胞培养特别受到重视。但上皮细胞培养中常混杂有成纤维细胞，培养时生长速度往往超过上皮细胞，并难以纯化，同时上皮细胞难以在体外长期生存，因此纯化和延长生存时间是培养关键。

体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜，因此培养在有胶原的底物上可能利于生长，另外人或小鼠表皮细胞培养在以 3T3 细胞为饲养层（用射线照射后）时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低 PH、Ca2 + 含量和温度，向培养基中加入表皮生长因子，均有利于表皮细胞生长。

以表皮细胞为例，用皮肤表皮和真皮分离培养法可获得纯上皮细胞，其法如下（黑木凳志夫 1981）1、取材：外科植皮或手术残余皮肤小块，早产流产儿皮肤更好，取角化层薄者，切成 0.5－1 平方厘米小块。

2、置 0.02% EDTA 中，室温，5 分钟。

3、换入 0.25% 胰蛋白酶中，4℃ 过夜。

4、分离：取出皮块，用血管钳或镊子将表皮与真皮层分开。

5、取出表皮，剪成更小的块后，置 0.25% 胰酶中，37℃，30—60 分钟。

6、反复吹打，制成悬液。

7、培养：用 80 目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸去上清。

8、直接加入培养基（Eagle 加 20% 小牛血清）制成细胞悬液，接种入培养瓶，CO2 温箱培养。

第二节 内皮细胞培养

内皮细胞易于从大血管分离培养成单层细胞，对于研究内皮细胞再生、肿瘤促血管生长因子（TAF）等有很大价值。

研究人内皮细胞培养以人脐带静脉灌流消化法最为简便，其法如下：

1、产后新鲜脐带，无菌剪取 10—15 厘米长一段，如不能立即培养，可于 12 小时内保存于 4℃。

2、用三通注射器吸取温 PBS 液注入脐静脉中洗去残血，在入口处用线绳扎紧，以防液体返流。

3、用血管钳夹紧脐带一端，从另一端向脐静脉中徐徐注入终浓度为 0.1% 的粗制胶原酶，充满血管，消化 3—10 分钟；注入口用线绳扎，以防液体返流。

4、吸出含有内皮细胞的消化液，于离心管中，注入温 PBS 轻轻反复冲洗后，一并注入离心管中（此步骤可重复）。

5、离心去上清，加入 RPMI1640 培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置温箱培养。两至三天可见细胞长成单层。

第三节 肌组织细胞培养

各种肌组织均可用于培养，以心肌和骨骼肌较实用。

（一）骨骼肌细胞培养

1、出生 1 一 2 天的乳鼠，引颈处死。

2、无菌取大腿肌组织，切成 0.3 一 0.5 cm2 小块后，用不含钙镁离子的 Hanks 液配的 0.25% 胰蛋白酶消化，无菌纱网或纱布滤过。

3、计数调整细胞密度。

4、快接种量 2×106 / 皿入培养基培养。

5、培养基内含 10% 小牛血清，可加 1% 的胎汁以促进分化。

接种在胶原或胶原的底物上能促进细胞分化，明胶配置：用 Hanks 液配成 0.01% 明胶。

该细胞接种率约 50%，细胞生长开始呈纺锤形，培养 50－52 小时后出现融合形成肌细胞状多核纤维。数日后融合停止，此时可观察到横纹，一般在融合后二、三天内能见到收缩现象。

（二）心肌细胞培养

心肌细胞是最早的培养材料，Carrel 曾长期培养过心肌组织，至今心肌仍不失为好的培养物，最常用的是鸡胚心肌。

心肌比较容易培养和生长，可用悬滴培养、组织块培养和消化培养法，均可获良好的效果。取心室肌培养较好，原代培养的鸡胚心肌呈纺锤形，培养成功时，一周后可见节律性收缩现象。

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