WB通关秘籍：是时候展现真正的技术了！

Western Blot是目前最常用的蛋白检测方法，几乎所有实验室都需要用到这个技术。但为什么背景这么高？怎么这么多非特异性条带？为什么条带拖尾？变形？最心塞的莫过于“没有条带。然后师兄，师姐，论坛，网站，各种求助，但结果却往往收效甚微。宝贵的青春，满满的自信就这样被实验一点点摧残，“苍天啊，大地啊”能不能赐我一本Western Blot通关秘籍！

1、目的蛋白信号弱

可能原因 ▏解决方案

样本上样量不足或者蛋白浓度过低 ▏加大上样量或者浓缩样品

抗体浓度偏低 ▏ 增加抗体浓度或者延长孵育时间

显色剂底物浓度不足 ▏ 增加显色剂用量

显色剂失效 ▏更换显色剂，显色剂A和B不可交叉混用

显色或曝光时间不足 ▏延长显色或曝光时间

2、转膜效率低

可能原因 ▏ 解决方案

转膜缓冲液PH值与目的蛋白等电点相近 ▏ 提高转膜缓冲液PH值

凝胶与转印膜之间存在气泡 ▏ 转膜时应排除所有气泡

凝胶与转印膜两侧滤纸大面积接触 ▏

滤纸、转印膜裁剪与凝胶大小相等

转印膜种类选择不当 ▏ 使用质量可靠的PVDF或者NC膜

电压或者电流过小 ▏ 调高电压或者电流

转印时间过短或者过长 ▏ 根据蛋白大小和装置类别选择合适的转印时间

湿转过程中温度过高 ▏ 使用预冷的转膜液，湿转置于冰水中

3、显色或曝光后无条带

可能原因 ▏解决方案

选用一抗、二抗或者显色液不合适 ▏更换一抗、二抗或者显色方法

目的蛋白低于检测下线 ▏ 加大上样量或者浓缩样品

抗体效价过低 ▏增加抗体浓度

抗体孵育时间不足 ▏增加孵育时间

抗体过度洗涤 ▏减少洗涤时间和次数

加入底物反应与曝光间隔时间过长 ▏减少间隔时间

4、Western blot背景高且不均匀

可能原因 ▏解决方案

封闭物用量不足 ▏提高封闭浓度，使用适当体积保证孵育时完全覆盖转印膜

封闭物使用不当 ▏检测生物素标记的蛋白时不可用脱脂奶封闭

封闭的时间不够 ▏延长封闭时间

抗体非特异性结合 ▏减少抗体的浓度和孵育时间

抗体浓度过高或洗涤不彻底 ▏降低抗体浓度，增加洗涤时间和次数

化学显色底物过多 ▏减少显色底物用量

5、非特异性条带

原因：一抗非特异性与蛋白结合

解决办法：更换一抗

经验：此种情况绝大多数是因为一抗不好，你无法判断哪一条是目的条带。如果实在没有更好的抗体，建议采用阴性对照和阳性对照来确定上述哪个条带是目的条带。当然这种情况下有一种很小几率的可能是一抗浓度太高引起的非特异性结合。

6、条带拖尾

原因：蛋白量太大，一抗浓度和时间太长

解决办法：根据情况调整蛋白量，同时一抗浓度和时间也可以缩短。

经验：这种情况很容易出现，因为很多原因都可能导致这一个结果。一般来说，蛋白量都是我们经过很多次摸索得出的最适蛋白量，因此不太可能是蛋白量过多引起的。最有可能的是因为一抗浓度太高，作用时间太长引起的。另外洗一抗和洗二抗千万不要偷工减料，建议5min*5次。

7、某个条带变形

原因：SDS-PAGE胶中存在气泡或者某不溶性颗粒

解决办法：配胶过程中要小心，使用无杂质的液体。

经验：很多实验室中使用的不是最新的设备，比如配胶用的海绵垫，如果用了很多年之后，会从下面往上面漏小气泡，当气泡足够小并且胶快凝固的时候，走到中间的小气泡就停留在胶内，并会影响到后面的跑胶。另外配胶用的水，SDS，Tris缓冲液要注意不要有杂质。

8、条带呈哑铃状

原因：配置胶有问题

解决办法：把胶配好，不合格的胶坚决不用

经验：出现哑铃最大的可能是胶没有配置好，胶凝固后不均一。另外还有一种可能是样品中含有太多杂质，没有离心下来，然后杂质沉积在孔的中间，蛋白自然被推挤到两边。

9、western显色的方法主要有以下几种：

1）放射自显影

2）底物化学发光ECL

3）底物荧光ECF

4）底物DAB呈色

现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

10、以下方法可增强发光强度

增强敏感性，若目的条带未出现，或很淡，可试用以下方法增强发光强度：

1）用清水漂洗膜数分钟，重加发光液进行曝光，可延长曝光时间。

2）将膜在PBST或TTBS中洗涤30min或更长，期间至少换2次液。

3）封闭40~60min一抗杂交，室温1h。

4）37℃ 1h 会更强，但可能增加非特异条带。

5）PBST或TTBS洗膜20min，期间换2次液。

6）二抗杂交，37℃ 1h。

7）PBST或TTBS洗膜20min，期间换2次液。

8）发光鉴定。

9）若条带仍未出现或很淡，可以再用PBST或TTBS洗涤膜20min，期间换2次液。

10）三抗杂交，室温1h。37℃ 1h 会更强，但可能增加非特异条带。三抗即抗二抗的二抗，比如二抗用羊抗兔，此时三抗可以选择兔抗羊或鼠抗羊等。

11）PBST或TTBS洗涤膜20min，期间换2次液。

12）发光鉴定。一抗溶液中加入0.2% 叠氮钠后可4℃存放至少2周（一个月我也用过，没问题，再长时间还没试）