文献解读 | 代谢组学揭示湿性老年性黄斑变性血浆生物标志物

代谢组学揭示湿性老年性黄斑变性血浆生物标志物

期刊：Aging

IF:5.515

发表时间：2021年5月

单位：四川省人民医院

组学技术：广泛靶向代谢组

一、研究背景

老年性黄斑变性(AMD)是导致失明的主要原因之一。随着世界人口老龄化，预计2040年AMD患者数量将增加到2.88亿。AMD是一种多因素疾病，年龄、高血压、动脉粥样硬化、糖尿病视网膜病变(DR)、吸烟和酗酒都会增加AMD的风险。另外，遗传因素对AMD的发生也有很大的影响。

AMD主要有两种类型：干性(萎缩性)和湿性(渗出性)AMD (wAMD)。在西方人群中，湿性AMD发生在大约10- 15%的AMD患者中，而在东方人群中比例更高。湿性AMD可分为脉络膜新生血管(CNV)和息肉状脉络膜血管病变(PCV)。湿性AMD在短时间内会导致中心视力严重恶化。目前wAMD的发病机制还不是很清楚。

二、研究思路

三、研究结果

1.筛选差异显著的代谢物

共鉴定代谢物545种。三维主成分分析(PCA)显示组间有分离趋势，表明组间有差异。主成分分析结果表明，PCV组和CNV组之间的差异最小，而对照组与CNV组差异最大(图1)。

图1 wAMD组、PCV组、CNV组PCA结果。(A, C, E, G)为各组PCA结果的二维图像；(B, D, F, H)为各组PCA结果的三维图像。

wAMD与对照组比较，VIP＞1的代谢物有164个，占所有代谢物的30.10%。与对照相比，CNV中有171种代谢物的VIP＞1(31.38%)。与对照组相比，PCV中有159种代谢物的VIP＞1(29.18%)。与PCV相比，CNV中有145种代谢物的VIP＞1(26.61%)。筛选差异代谢物，共检测到24个在疾病和对照之间有显著差异的代谢物。这些代谢物包括氧化脂质(25.00%)、苯及其衍生物(16.67%)、核苷酸类(12.50%)和氨基酸类(12.50%)(表1)。

表1不同类型的代谢物

2.疾病组与对照组的代谢物有显著差异

wAMD患者和对照组之间共有17种显著差异的代谢物(图2和图3)。这些代谢物包括6种氧化脂质((±)12-HEPE， (±)12-HETE， (±)4- HDHA， (±)9-HETE, 14(S)-HDHA和15-oxoETE)，2种苯及其衍生物(2,4-二羟基苯甲酸和1,2,3-三羟基苯)，2种有机酸及其衍生物(1-甲基尿酸和氨基甲酰磷酸)，2种氨基酸衍生物(氧化三甲胺和L -色氨酰胺盐酸盐)，2种核苷酸衍生物(1-甲基黄嘌呤和尿苷二磷酸葡萄糖)，1-氨基丙烷-2-醇，2-甲氧基苯甲酸和维生素D3。除尿苷二磷酸葡萄糖和氨基甲酰磷酸盐在wAMD中相对含量较低外，其他代谢物在wAMD中相对含量较高，说明这些代谢物在wAMD患者的血浆中积累。

CNV与对照有显著差异的代谢物。CNV组与对照组相比，共发现14个显著差异代谢物。这些代谢物包括(±)4-HDHA和15-oxoETE(氧化脂质)，2-甲基苯甲酸和2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(苯及其衍生物)，1-甲基尿酸和氨基甲酰磷酸(有机酸及其衍生物)，氧化三甲胺和L -色氨酰胺盐酸盐(氨基酸及其衍生物)，尿苷二磷酸葡萄糖和磷脂胆碱(核苷酸衍生物)，1-氨基丙烷-2-醇(醇类)，2-甲氧基苯甲酸(苯甲酸及其衍生物)，维生素D3 (辅酶因子和维生素类)和o -磷酸乙醇胺(其他类)。除o -磷酸乙醇胺、尿苷二磷酸葡萄糖和氨基甲酰磷酸盐在CNV中表达下调之外，其他在CNV中表达上调。

PCV与对照组的代谢物差异显著。与对照组相比，PCV患者中发现了9种显著差异的代谢物，且其中大多数也是与湿性AMD相关的代谢物(图2和图3)。在PCV组中特异性检测到以下三种代谢物：1-甲基黄嘌呤(核苷酸类)、对苯二酚(酚类及其衍生物)和L-丙氨酰-L-赖氨酸(氨基酸类)。其余6种差异代谢物与CNV组共有，提示二者在代谢水平上有密切联系。

CNV与PCV的代谢物存在显著差异。在CNV与PCV的比较中发现了两个显著差异的代谢物：猪脱氧胆酸(胆汁酸)和L-色氨酰胺盐酸盐(氨基酸)(图2和图3)。

图2 wAMD组、PCV组、CNV组的Venn图

图3 wAMD组、CNV组、PCV组差异代谢物的相对含量小提琴图

对差异代谢物进行KEGG注释。根据KEGG中代谢物的通路类型进行分类(图4)，结果显示涉及的代谢途径包括维生素消化吸收、嘧啶代谢、生物合成、代谢途径、甘油磷脂代谢等途径。

图4差异代谢物的KEGG通路分类及富集分析

3.AMD主要基因CFH和HTRA1的不同基因型患者的代谢物有差异

AMD是一种多因素疾病，遗传在疾病的发病机制中起着重要作用。既往研究表明HTRA1和CFH是AMD的两个主要基因。为了确定不同基因型之间血浆代谢物是否存在差异，作者检测了参与者CFH r800292和HTRA1 rs10490924基因型(均属于CFH和HTRA1敏感位点的单倍型)，并分析了代谢物及其等位基因间的差异。本次分析共鉴定出12个差异代谢物。

CFH rs800282基因型间代谢物差异显著。根据CFH rs800292三个基因型中检测到的代谢物的PCA分析结果(图5A、5B)，基因型之间的变异程度较小，特别是基因型AA和基因型AG之间。利用OPLS-DA S-plot直接显示各组VIP值大于1或小于1的代谢物所占比例(图5C)。在GG和AA基因型之间共有6种差异代谢物(1-甲基黄嘌呤、L-岩藻糖、3-羟基丁酸、丙二酸、2,4-二羟基苯甲酸、(±)4-HDHA)(图5D)。GG和AG基因型之间没有显著差异的代谢物。根据KEGG分析，这6种差异代谢物主要参与酮体的合成和降解、嘧啶代谢、果糖和甘露醇代谢、脂肪酸代谢、脂肪酸生物合成、cAMP信号通路和c型凝集素受体信号通路(图5E, 5F)。

图5 CFH rs800292 基因型GG与AA比较

HTRA1 rs10490924基因型间的代谢物存在显著差异。与CFH相似，PCA分析结果显示，HTRA1 rs10490924的三个基因型差异较小(图6A -6D)。HTRA1 OPLS-DA Splot用于直观显示各组VIP值大于1或小于1的代谢物的占比情况(图6E, 6F)。

图6. HTRA1 rs10490924的3个基因型PCA结果和OPLS-DA S-plot

根据差异代谢物筛选标准，GG与AA之间鉴定出5种差异代谢物(环拉酸、吲哚基硫酸、苯乙酰-L-谷氨酰胺、3-吲哚丙酸、2-苯乙酰胺)(图7A、7B)，HTRA1基因型AA中5种代谢物的相对含量均高于GG组。GG和AG之间存在4种差异代谢物(氨基甲酸乙酯、吲哚基硫酸、苯乙酰-L-谷氨酰胺和2-苯乙酰胺)。KEGG分析显示，主要与酪氨酸代谢、苯丙氨酸代谢密切相关(图7C-7F)。

图7 HTRA1 rs10490924的三种基因型患者的差异代谢物相对含量及KEGG通路富集

4.鉴定wAMD患者血浆中微生物来源的特异性代谢产物

众所周知，微生物与人类疾病密切相关。为了探究微生物的代谢产物是否参与了wAMD的发生，作者鉴定出24个微生物特异性代谢产物(表6)。以有机酸及其衍生物为主(N = 6, 25.0%)，其次是苯及其衍生物(N = 4, 16.67%)。然而，这些代谢物在疾病组和对照组之间没有显著差异。其中，HTRA1 rs10490924基因型GG和AA之间的环拉酸存在差异，且在AA基因型的相对含量高于GG基因型。

表6. 微生物特异性代谢产物

5.体外功能验证

为了进一步探索这些差异代谢物的作用，作者选择了环拉酸、猪脱氧胆酸、L -色氨酰胺盐酸盐和o -磷酸乙醇胺这4种代谢物，研究它们对与AMD发病机制密切相关的人视网膜色素上皮细胞(HRPECs)和原代人视网膜内皮细胞(HRECs)的影响。

代谢物对HRPECs的影响：四种代谢物和对照在HRPECs中的CCK-8细胞增殖和细胞毒性检测结果见图8。与阳性对照姜黄素相比，30μmol/ml和40μmol/ml的环拉酸处理HRPECs 24h和48h，显著抑制HRPECs活性。10μmol/ml和20μmol/ml环拉酸处理48h，显著抑制HRPECs增殖(图8B)。与阳性对照姜黄素相比，猪脱氧胆酸和L -色氨酰胺盐酸盐对HRPECs活性没有显著影响(图8C- 8E)。然而，L -色氨酰胺盐酸盐处理48h后对HRPECs的增殖抑制率高于姜黄素(图8F)。与阳性对照姜黄素相比，o -磷酸乙醇胺增加了HRPECs的活性，表明其对HRPECs的增殖有促进作用(图8G，8H)。

图8环拉酸、猪脱氧胆酸、L -色氨酰胺盐酸盐和o -磷酸乙醇胺对HRPECs活性和增殖的影响

四种代谢物处理HRPECs后的细胞凋亡和坏死检测结果见图9。与阳性对照姜黄素相比，环拉酸处理HRPECs增加了细胞凋亡和坏死。猪脱氧胆酸、L -色氨酰胺盐酸盐和o -磷酸乙醇胺对HRPECs的影响在姜黄素和DMSO之间。

图9 4种代谢物作用48h后HRPECs的凋亡和坏死。蓝色荧光表示正常细胞，亮蓝色表示凋亡细胞，红色表示坏死细胞。

代谢物对HRECs的影响：作者使用HRECs进行了成管实验(图10和表11)。用20μmol/ml时，小管数量较对照组增加。而更高浓度(30μmol/ml和40μmol/ml)处理后，不能形成小管，提示存在浓度依赖效应。经猪脱氧胆酸处理的HRECs中的小管数量与DMSO组没有差异，但显著高于血管生成抑制剂贝伐单抗组。L -色氨酰胺盐酸盐处理的HRECs中的小管数量明显多于DMSO和贝伐单抗组，表明该物质具有促进血管形成的作用。与对照组和贝伐单抗组相比，o -磷酸乙醇胺处理的HRECs显示出更低的血管生成能力，表明该物质对HRECs具有抑制血管生成的作用。

用选定的4种代谢物处理HRECs的伤口愈合试验结果见表12。与贝伐单抗相比，环拉酸治疗后HRECs的迁移率显著降低。猪脱氧胆酸治疗后，迁移率较贝伐单抗降低。L -色氨酰胺盐酸盐处理后，与DMSO相比，迁移率增加。HRECs在5 μmol/ml o -磷酸乙醇胺作用后的迁移率高于贝伐珠单抗，而在10-20 μmol/ml o -磷酸乙醇胺作用后的迁移率低于贝伐珠单抗，存在浓度依赖性效应。

表12 HRECs迁移速率

四、研究结论

基于代谢组学寻找与湿性老年性黄斑变性相关的血浆生物标志物，发现有4种重要的生物标志物（环拉酸、猪脱氧胆酸、L -色氨酰胺盐酸盐和o -磷酸乙醇胺）对wAMD发病相关HRPECs和HRECs有一定的影响，这将为wAMD的诊断和发病机制研究提供潜在的靶点。