脂肪干细胞的分离培养及注意事项

一准备工作：

所需要的试剂的准备，包含：

PBS，双抗，胶原酶，胰酶，细胞完全培养基，红细胞裂解液等

二分离步骤：

1. 将脂肪组织块放在培养皿内，加少量含双抗的PBS，用剪刀和镊子去除血管及结缔组织后剪碎成泥状。

2. 将剪碎的脂肪组织转入离心管（如果是脂肪颗粒可省去步骤1），加入含双抗的PBS清洗3次，清洗脂肪和去除杂细胞。

3. 清洗后将脂肪组织转到新的离心管中，按照1:1比例加入胶原酶消化。

4. 37度水浴消化，5分钟摇晃一次。直至摇晃脂肪颗粒消失，液体达到均一的状态。

5. 离心，去除上层组织和液体，保留离心管底部的细胞。

6. 观察，如果红细胞比较多的话可加红细胞裂解液适当裂解。

7. 加入PBS清洗后离心。

8. 用细胞完全培养基重悬计数，按照8000个/cm2接种至培养瓶，并补充适量培养基。

三P0代细胞培养：

1. 分离后的72小时内尽量不要移动培养瓶，待72小时后，换液，此时可看到有细胞贴壁。

2. 此后可2-3天换一次液。

3. 直至细胞融合度达到90%以上时可进行消化传代。

四细胞传代：

弃去培养基，加入PBS清洗，加入胰酶消化直至细胞脱落，加入终止液终止消化，收集悬液离心，去除上清，加入培养基重悬后计数。按照5000-6000个/cm2接种。

注意事项：

1. 分离时候由于组织来源的差异，消化时间会有较大差别，具体以消化后状态决定什么时候消化完全。消化时间一般在15-30分钟。

2. P0代的培养，由于组织来源的差异，细胞融合度达到90%时间也会有较大差别。

3. 不同品牌的MSC培养基会使得细胞的贴壁能力有较大差异，若细胞贴壁比较牢，可直接用0.25%的胰酶进行消化；若贴壁不牢可用稀释过的胰酶消化，或者可以用重组酶消化，避免消化过度影响细胞状态。