血型分子分型技术补充篇---核酸质谱

小编写过一篇血型基因检测相关的文章“血型基因检测的思考”，其中提到多种血型基因检测技术，经了解，核酸质谱技术也是很好的解决方案，此文着重介绍该技术在血型基因检测中的应用特点。

血型基因检测现状及特点

对血型基因检测的需求，特点及市场分析，在临床输血公众号文章“血型基因检测的思考”中有更详细的阐述，此处简单概括如下：

（一）          常规血型分析主要对ABO，Rh(D)血型进行血清学分析，会有一定概率出现分型不符；且无法覆盖其它红细胞血型系统，无法实现精准输血，多次输血患者可能因匹配不精确产生抗红细胞抗体导致无血可用的地步。血型基因检测有希望解决常规血清学分析面临的这些问题，有助于临床精准输血最终实现电子交叉配血，在供者（献血者）及受者（需输血患者）的血型信息足够充分的情况下，可以实现免除配血，直接电子匹配发血，更加精准、高效。

（二）          血型多由等位基因控制，截至2021年2月，ISBT确认的血型系统为43个，而临床意义较为显著的血型系统包括ABO、Rh(D)、Kell、Duffy、Kidd、Diego、Lewis、P、MNS、Lutheran、Xg等，其不同亚型之间区别往往在于单个核苷酸的不同，因此血型基因分型技术要满足高准确性的多重SNP分型需求；考虑到进行人群筛查或稀有血型建库，则还需要基因分型技术能提供较大的样本通量及较低的检测成本。

（三）          血型基因分型如仅做ABO及Rh鉴定，市场较小，现阶段ABO微柱凝胶尘埃检测仅20元/样本左右，基因检测在这块应用没有成本优势；其它稀有血型鉴定（Kelly，Kell、Duffy、Kidd、Diego、Lewis、P、MNS、Lutheran、Xg等），抗原检测收费约20元/项，理论上检测套餐收费可达300-400元，则有较好市场前景；且基因检测平台可拓展血小板抗原检测（HPA），白细胞抗原检测（HLA）等基因分型应用项目，可提高整体精准输血水平，更好地服务患者。

常见血型基因检测方法比较

目前血型基因检测试剂，大部分采用PCR-SSP检测方法，存在操作较为繁琐，需要电泳显色等手段人工判读结果，多重分析能力较弱等缺点，因此实用性不强。

临床上常用的基因检测技术包括荧光定量PCR，基因芯片，核酸质谱，高通量测序等，均可在一定程度上实现多重SNP分型，各技术本身的特点决定了有最合适的应用范围。

一般来说荧光定量PCR单位点或少量位点检测应用有较大优势，主要体现在平台成本低，试剂获取容易，操作和数据分析简单；高通量测序在大量位点或新发突变检测应用上有较大优势，但存在开机成本高，平台运行维护及数据分析复杂等问题；核酸质谱在数十到上百位点检测范围内，有较大优势，主要体现在检测成本较低，可灵活设计多重检测，结果准确度高，操作和数据分析简单，但是由于使用质谱平台，仪器成本较高。

从血型分型要求特点来看，单一特定血型的鉴定需求，荧光定量PCR可以较好的解决，可作为特定血型的补充测试方法。

高通量测序因检测成本较高，实际应用面临困难较大，一般常用于未知基因变异的研究中。

核酸质谱在中等数量靶点的基因检测中，有较大优势，适用于开发多种血型系统基因分型的应用。

核酸质谱技术在血型基因分型中的应用

据了解，德国红十字会，瑞士红十字会，美国红十字会，澳大利亚红十字会均有使用Agena公司的核酸质谱平台进行多种稀有血型分型应用，从他们公开发表的文献中我们可以了解一下他们的应用情况：

该文献发表于Transfusion Medicine Reviews，作者Christoph Gassner博士介绍了由瑞士红十字会与德国合作的血型分型项目，基于MALDI-TOF MassARRAY技术方法来筛查170个等位基因编码的101个血型系统的稀有血型，涉及Rh， Kell，Duffy， MNSs，血小板（HPA)及粒细胞(HNA）抗原。研究者在核酸质谱平台上开发应用了6款panel，其中2款专门用于Rh，1款Kell-Kidd-Duffy，1款MNSs，1款稀有血型抗原，一款HPA/HNA分型。一共测试36000份Swiss DNAs样品。作者在结论中评价检测成功率，数据质量和与已知样本的一致性都令人印象深刻，表明该技术在实现低成本高通量的同时，保证了高度的准确性和稳定性。

该文献发表于Transfusion，作者Stefan Meyer将MassARRAY核酸质谱方法和传统血清学进行血型分析对比，在6天内完成一共4000例献血者样品，单反应同时检测15个SNP，进行Kell-Kidd-Duffy血型系统分型，K/K 、Kp^a/b 、Jk^{a /b} 和所有 Fy^{a /b} 特异性的基因型/表型一致性分别为 100% 、99.98% 、99.93% 和99.20% 。基因型与表型的差异是由错误的血清学结果（ n=33 ） 引起的 ，主要归因于弱表达Fy^x （n=28 ），作者认为核酸质谱方法基因分型在通量，操作简便都和准确定都比血清学分析好，从技术角度上讲，在这三个血型分型应用中，基因分型应当取代血清型方法。

美国红十字会血液中心自2011年开始已经累计完成220,000献血者的血型基因分型，自建立MassARRAY核酸质谱平台以来，多次在美国血库协会年会（AABB - the American Association of Blood Banks）中介绍他们使用该平台进行血型基因分型的应用，同时他们针对自身对特定血型分型的需求，开发了多个血型基因检测试剂盒，均取得较好的验证结果。

此外，Agena公司提供成熟的稀有血型测试试剂盒Hemo ID® DQS试剂盒，可同时检测以上列表中12个血型系统中的42个抗原和3个β球蛋白标记，感兴趣的可以去Agena官网了解一下： https://china.agenabio.com/products/panel/hemo-id-dqs-panel/

核酸质谱技术在血小板抗原（HPA）基因分型中的应用

HPA可介导同种抗体的产生，引起同种免疫反应，引发同种免疫性血小板减少，如输血后血小板减少性紫癜（PTP）、血小板输注无效（PTR）及新生儿同种免疫血小板减少性紫癜（NAITP），同时在临床移植中，还会引起移植排斥等相关的疾病。文献报道，约20%-50%的白血病患者，80%再障患者在长期输注血小板后，发生血小板输注无效症（PTR）。国内文献曾报道，血小板输注无效率达到约30%~70%。准确检测和鉴定HPA，对于临床医学和输血实践具有重要意义。

以上文献为德国红十字会早期发表的应用MassARRAY核酸质谱平台进行血小板抗原（HPA）基因分型的应用，作者对对核酸质谱技术在血小板抗原基因分型中的潜力进行了验证，基因分型中的潜力进行了验证， 并建立了一种有效的临床相关人类血小板抗原基因分型方法。研究针对6个HPA基因座（ HPA-1、 HPA-2、HPA-3、HPA-4、HPA-5和HPA-15 ）设计多重分析方法，经PCR-SSP和一代测序对比表明，核酸质谱方法具有速度快、多靶点、样品通量高，自动化程度高等优点，使得大规模HPA分型具有成本效益，可用于临床应用。

目前已经确定的血小板抗原（HPA）一共33个，其基因背景均已研究清楚，其中32个HPA均具有单核苷酸多态性（SNP）；HPA-14bw不是由SNP引起，其基因是因核苷酸1909到1911位置上AAG3个碱基缺失产生。通过核酸质谱平台，可将常见HPA基因分型同时检测，可低成本实现对健康人群，受血者，需长期输注的患者进行精准HPA分型，建立已知HPA基因型的血小板库，提高血小板输注的匹配精确性，降低输血后紫癜及血小板办输注无效症等疾病的发生。