生物样本分析基质效应和提取回收率做法

一、蛋白沉淀法

样品处理方法：

40μL样品+10μL内标工作液+300μL沉淀剂（离心）→上清100μL+400μL稀释剂，混匀进样。

方法1：非提取基质样品和纯溶液样品：

100μL上清液+10μL折算后的待测物工作液+10μL折算后的内标工作液+380μL稀释剂；

方法2：非提取基质样品和纯溶液样品：

100μL上清液+20μL（折算后的待测物+内标混合工作溶液）+380μL稀释剂；

方法3：非提取基质样品和纯溶液样品：

100μL上清液+400μL（折算后的待测物+内标混合工作溶液）。

1、按照以下样品处理方法进行计算举例：

100μL上清液+10μL折算后的待测物工作液+10μL折算后的内标工作液+380μL稀释剂；

计算方式一：稀释倍数法

待测物提取后样品/基质效应样品：

待测物：20倍（2μL工作液稀释到38 μL空白基质中）X 350/40（40 μL样品稀释到10 μL内标+40 μL样品+300 μL沉淀剂中） X 5（100 μL上清稀释到500 μL处理液中） = 875倍

未提取样品和纯溶液样品：10 μL待测物工作液稀释到500 μL处理液中=50倍

待测物稀释倍数=875倍/50倍=35/2=700/40

配制基质效应和未提取样品待测物工作液：40 μL待测物（QCL或H）工作液+660 μL稀释液

内标提取后样品和基质效应样品：

内标：35倍（ 350/10 ） X 5 倍（100 μL上清稀释到500 μL处理液中）= 175倍

未提取样品和纯溶液样品：10 μL内标工作液稀释到500 μL处理液中=50倍

内标稀释倍数=175倍/50倍=700/200

配制基质效应和未提取样品内标工作液：200 μL内标工作液+500 μL稀释液

计算方式二：浓度等式法（C1V1=C2V2）

待测物：2μL工作液/40μL样品  X 40μL样品/350μL处理液 X 100μL上清/500μL处理液 X C1

= 10μL/500μL处理液 X C2

即得， C2=20/350 X C1=40/700 X C1

配制基质效应和未提取样品待测物工作液：40 μL待测物（QCL或H）工作液+660 μL稀释液

内标：10μL工作液/350μL处理液 X 100μL上清/500μL处理液 X IS1

= 10μL/500μL处理液 X IS2

即得，IS2=100/350 X IS1=200/700 X IS1

配制基质效应和未提取样品内标工作液：200 μL内标工作液+500 μL稀释液

2、按照以下样品处理方法进行计算举例：

非提取基质样品和纯溶液样品：

100μL上清液+20μL（折算后的待测物+内标混合工作溶液）+380μL稀释剂；

待测物：2/40 X 40/350 X 100/500 X C1= 20/500 X C2

即得， C2=20/350 X C1=10/350 X C1=20/700 X C1

内标：10/350 X 100/500 X IS1= 20/500 X IS2

即得，IS2=50/350 X IS1=100/700 X IS1

混合工作液=20μL待测物（QCL或QCH）工作液+100 μL内标工作液+580μL稀释剂

3、按照以下样品处理方法进行计算举例：

非提取基质样品和纯溶液样品：

100μL上清液+400μL（折算后的待测物+内标混合工作溶液）稀释剂；

待测物：2/40 X 40/350 X 100/500 X C1= 400/500 X C2

即得， C2=1/700 X C1

内标：10/350 X 100/500 X IS1= 400/500 X IS2

即得， IS2=1/140 X IS1 =5/700 X IS1

混合工作液=1μL待测物（QCL或QCH）工作液＋5 μL内标工作液+（700－1－5）μL稀释剂

综上，可以进行快速折算：

400 μL（待测物和内标在处理液中的总体积）-（2 μL待测物工作液在样品中的体积X100 μL上清/350 μL处理液+10 μL内标工作液在处理液中的体积X100 μL上清/350μL处理液）

V=400－（2 X 100/350＋10 X 100/350）→通分

V=400 X 350－2 X 100－10 X 100

V=700－1－5

V=694 μL稀释剂＋1 μL待测物（QCL或QCH）工作液+5 μL内标工作液

二、液液萃取法

样品处理方法：

提取后样品和基质效应样品：

40μL样品+10μL内标工作液+1000μL萃取剂→上清700 μL氮气挥干→200μL复溶液复溶进样。

未提取样品和纯溶液样品：

Double Blank样品 →上清700 μL氮气挥干→ 200 μL复溶液（含待测物和内标）复溶

浓度等式法（C1V1=C2V2）

待测物：2 μL工作液/40 μL样品 X 40 μL样品/1000 μL萃取剂 X 700 μL上清/200 μL复溶液（含待测物和内标） X C1= C2

即得， C2=14/2000 X C1

内标：10μL工作液/1000μL萃取剂 X 700上清/200μL复溶液（含待测物和内标）X IS1= IS2

即得， IS2 =70/2000 X IS1

混合工作液=14 μL（QCL或QCH）工作液＋70 μL内标工作液+（2000－14－70）μL稀释剂

混合工作液=14 μL工作液＋70 μL内标＋1916 μL稀释剂

综上，可以进行快速折算：

200 μL（待测物和内标在混合工作液中的总体积）-（2 μL待测物工作液在样品中的体积X700μL上清液/1000 μL处理液+10 μL内标在处理液中的体积X100 μL上清/1000 μL处理液）

V=200－（2 X 700/1000＋10 X 700/1000）→通分

V=200 X 1000－2 X 700－10 X 700

V=2000－14－70

V=1916 μL稀释剂＋14 μL待测物（QCL或QCH）工作液+70 μL内标工作液

注意要点：

（1）需要根据具体的样品处理步骤进行调整，请首先使用快速折算法进行计算，然后根据具体的实验步骤，进行浓度等式法或倍数稀释法进行回算，确保计算正确，配制正确；

（2）待测物在处理液稀释剂中溶解度较好，低、中、高浓度的基质效应和提取回收率趋势一致的化合物，推荐使用Double Blank样品 →100μL上清+400 μL稀释剂（含待测物和内标）；

（3）待测物在处理液稀释剂中溶解度较低，推荐使用Double Blank样品 →100 μL上清+20 μL稀释剂（含待测物和内标）+380 μL稀释剂；

（4）液液萃取法，推荐使用Double Blank样品 →上清700 μL氮气挥干→ 200 μL复溶液（含待测物和内标）复溶

（5）离心后直接取上清液进样：

处理程序为：40 μL样品+10 μL内标工作液+300 μL沉淀剂→取200 μL上清直接进样；

推荐使用Double Blank样品 →200 μL上清含待测物和内标（或使用上清替代溶液）

未提取样品和纯溶液样品：

200μL上清含待测物和内标=10 μL含待测物和内标溶液 +190 μL空白上清。

完！