流式-ROS

该流程将使用到由碧云天生物技术提供的活性氧检测试剂盒，仪器为BD-C6流式细胞仪，细胞株为子宫内膜癌ishikawa细胞株。

1.铺板

挑选状态好的细胞，铺一个六孔板。铺板时十字摇晃将细胞铺匀，根据后续处理时长调整铺板密度。

2.加药

设置分组：空白对照组（不加药，不加探针，用来圈门），探针对照组（不加药，后续处理加入探针），实验组（加药，后续处理加入探针），试剂盒中提供阳性对照物rosup，可根据需要设置阳性对照。

3.处理

细胞收集：收集上清于流式管内（1.5ml的ep管也可以），pbs洗一次，每孔加入500ul的胰蛋白酶，置于培养箱中消化1-2min，镜下观察细胞状态，细胞失去正常形态，变圆，并伴随少量漂起时将上清倒回对应的孔中以终止消化。吹打并收集各孔细胞入对应流式管。1000rpm离心5min。

细胞清洗：使用PBS离心洗涤3次（弃上清，留下细胞)。

探针孵育：每管加入1ml稀释好的DCFH-DA（10um/l）置于培养箱中避光室温孵育20min，每隔3-5min摇晃流式管一次。注意探针孵育过程中尽量避光，超净台中操作应关闭光源。

上机准备：孵育结束后使用无FBS的培养基离心洗涤三次，加入300μl的PBS重悬细胞，置于冰上即可上机检测。

参数：SSC-A,FSC-A,FL1-A,10000事件，中速。

4.上机：上机前将细胞吹打均匀，不可有细胞团块，细胞密度也不可过密。空白对照组用来圈门，详情可以参考【原创】流式细胞技术-ROS检测，测出各组图后，点击analyze后绿色箭头处图标即可将几张图图整合到一张图中。