CRISPR技术有效防止脱靶现象的方法学评估

CRISPR/Cas9 基因编辑系统是第三代基因编辑技术，在生物医学领域有着广泛的应用。该系统由 sgRNA 和 Cas9 蛋白组成，sgRNA 与 Cas9 结合并引导 Cas9 到达 DNA 靶点，Cas9 作为核酸内切酶对靶序列进行切割，形成 DNA 双链断裂(double strand break, DSB)。DSB 通过两种机制———非同源末端连接(nonhomologous end joining, NHEJ)和同源重组介导的修复(homology-directed repair, HDR)———进行修复，实现特定基因的敲 除或插入。与锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)等基因编辑工具相比，CRISPR/

Cas9 在简便性、专一性等方面有很大优势，但脱靶效应一直是它在实际应用中面临的一个难题。目前已有许多针对脱靶效应的研究，科学家们已发现一些影响靶点专一性的因素，如 sgRNA 种子序列、PAM 序列、Cas9 蛋白、DSB 修复通路等，并据此研发出降低脱靶效应的可行性策略。

研究表明，CRISPR/Cas9 系统可能存在大量脱靶突变，对于细菌和古生菌来说，脱靶突变可以帮助破坏高变的病毒核酸或质粒 DNA，但对于生物学研究和基因治疗，脱靶突变会影响基因编辑的精确性 (Peng et al., 2016)。2017 年，《Nature Methods》杂志上一篇名为《Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo》的文章报道了 CRISPR/Cas9 在老鼠 体内引起的脱靶效应，在 CRISPR/Cas9 研究领域造成极大轰动，尽管此后这篇文章因为数据不充分已被撤回，但脱靶效应依然是 CRISPR/Cas9 系统广泛应用面临的一个难题。

目前认为，脱靶效应出现的主要原因是 SpCas9 能够容许 sgRNA 与 DNA 的错配(Bolukbasi et al., 2016)，SpCas9 能在与 sgRNA 部分匹配的 DNA 靶点 进行切割。部分匹配大致有两类：

(1) sgRNA 与靶点外的 DNA 序列长度相同，存在碱基错配；

(2)靶点外的 DNA 与sgRNA 长度不同，通过形成 DNA 凸起或RNA 凸起完成其他碱基的正确配对(郑武和谷峰, 2015)。在一些高达 4 或 5 个碱基错配的脱靶位点，核酸酶依然表现出活性(Bolukbasi et al., 2016)，研究发现一些脱靶位点存在碱基凸出或者 sgRNA 和 DNA 序列存在高达 13 个碱基的错配(Martin et al., 2016)。

在此以一种非常成熟的关于CRISPR基因编辑防脱靶、高效编辑系统   一IDT Alt-R™ CRISPR-Cas9 系统为例说明：

IDT（Integrated DNA Technologies）作为核酸定制合成领域的知名企业，依托30年来的技术研发，推出了Alt-R系列CRISPR-Cas9基因编辑产品，通过对gRNA序列、Cas9核酸酶优化，对RNP转染效率、同源重组修复HDR效率的提升，形成了从crRNA设计到CRISPR编辑结果检测的一站式解决方案，让CRISPR-Cas9系统更高效、更简单。

Alt-R CRISPR-Cas9概述

IDT的Alt-R CRISPR-Cas9系统，分别对crRNA、tracrRNA、sgRNA序列进行优化缩短、化学修饰，对化脓性链球菌S. pyogene Cas9内切酶结构域进行突变，获得了高精确性的单链、双链剪切功能，再通过电穿孔（如Lonza Nucleofector核转染系统）转染RNP，可进行精确地基因编辑操作。

传统构建CRISPR-Cas9质粒的方法，质粒大小高达6-10kb，很难转染，而如使用原代细胞等难转染的细胞，转染效率更低。且质粒不断产生CRISPR-Cas9，使脱靶率显著增加。IDT转染RNP蛋白复合体的方法，通过优化CRISPR-Cas9组件，在提升剪切精确性的基础上，提高转染效率、减少细胞毒性、降低脱靶，进而提高了基因编辑效率。

Alt-R CRISPR-Cas9实验流程

【方法一】

1、（使用IDT序列设计工具）设计Alt-R crRNA，使其间隔区（Spacer）序列与DNA靶序列互补，提交给IDT定制合成crRNA；

2、将Alt-R crRNA与Alt-R tracrRNA混合，通过crRNA的重复序列区（Repeats）与tracrRNA碱基配对, 形成向导RNA（guide RNA，简称gRNA）；

3、将gRNA与Alt-R Cas9蛋白混匀，形成核糖核蛋白体（ribonucleoprotein，简称RNP)；

4、将RNP通过电转染等导入细胞或细胞核；

5、通过crRNA的Spacer识别DNA靶序列，通过Cas9蛋白识别PAM序列（前间区序列邻近基序，protospacer adjacent motif，简称PAM），对DNA进行剪切；

6、对DNA断裂处进行修复

①进行非同源末端连接修复(Non-homologous end-joining，简称NHEJ），实现基因敲除（knockout）；

②（使用IDT序列设计工具）设计供体DNA模板，进行同源重组修复（Homology directed repair，简称HDR），实现基因敲入（knockoin）、基因敲除、基因沉默等。

【方法二】

1、（用IDT工具）设计sgRNA，使其Spacer与DNA靶序列互补，提交给IDT定制合成sgRNA；

2、将sgRNA与Cas9蛋白混匀，形成RNP；

3、将RNP通过电转染等导入细胞或细胞核；

4、通过sgRNA的Spacer识别DNA靶序列，通过Cas9蛋白识别PAM序列，对DNA进行剪切；

5、对DNA断裂处进行修复

①进行非同源末端连接修复，实现基因敲除；

②（用IDT工具）设计供体DNA模板，进行同源重组修复，实现基因敲入、敲除、沉默等。

Alt-R crRNA序列设计示意图

Alt-R CRISPR-Cas9产品

1、Alt-R crRNA：由19-20nt特异性序列（定制）和16nt通用序列融合形成，相比野生型，序列更短，中靶率更高。经化学修饰防止被细胞核糖核酸酶降解，必须与tracrRNA一起使用以形成gRNA。

2、Alt-R crRNA XT：相比Alt-R crRNA，经其他化学修饰，用于高核酸酶条件或带有Cas9 mRNA的实验，可提高编辑的稳定性。必须与tracrRNA一起使用。

3、Alt-R sgRNA：由crRNA和tracrRNA序列融合组成的单个RNA，含有19-20nt的特异性序列（定制）和80nt通用序列，经化学修饰，稳定性更高，用于高核酸酶条件或带有Cas9 mRNA的实验。相比体外转录的sgRNA，减少细胞免疫反应，更小细胞毒性。

4、Alt-R tracrRNA：通用67nt序列，远远短于野生型的89nt，缩短后性能提高，经化学修饰，具有核酸酶抗性。可提供荧光标记，检测转染效率。必须与crRNA一起使用以形成gRNA。

图.稳定表达Cas9蛋白的HEK-293细胞，转染Alt-R crRNA(未标记):tracrRNA(标记)，转染后48小时，荧光显微镜下10倍放大。

5、Alt-R Cas9核酸酶：S. pyogene来源Cas9，大肠杆菌表达纯化，添加核定位序列（Nuclear localization sequence，NLS）和C端6-His标签。Alt-R HiFi Cas9高保真核酸酶，经序列优化，提高中靶率，降低脱靶率。以10μg/μL的溶液提供。100μg Cas9核酸酶=610pmol。

6、Alt-R Cas9切口酶：S. pyogene来源Cas9，大肠杆菌表达纯化，添加核定位序列NLS和C端6-His标签。其中Alt-R Cas9 D10A切口酶中RuvC-like内切酶结构域功能失活，对DNA靶向链进行单链切割。Alt-R Cas9 H840A切口酶，HNH结构域失活，对非靶向链单链切割。以10μg/μL的溶液提供。100μg Cas9切口酶=610pmol。

7、Alt-R dCas9蛋白：S. pyogene来源Cas9，大肠杆菌表达纯化，丧失内切酶功能，添加核定位序列NLS和C端6-His标签。dCas9蛋白可用于CRISPRi，进行基因下调（knockdown）等，相比RNAi，由于CRISPRi需要在转录起始位点附近才能发挥功能，其脱靶率远低于RNAi。Alt-R dCas9蛋白，以10μg/μL的溶液提供。100μg dCas9蛋白=610pmol。

8、Alt-R Cas9电穿孔Enhancer：是Cas9特异性的载体DNA，当使用原代细胞或难转染细胞时，可提高Lonza(原Amaxa）Nucleofector核转染系统等电穿孔设备对RNP的转染效率，进而提高基因编辑效率。

9、Alt-R HDR Enhancer：小分子化合物，可提高同源重组修复概率。在包括贴壁、悬浮的大量细胞系中均有活性，可用于Cas9核酸酶、Cas12a（Cpf1）核酸酶。

10、Alt-R HDR供体寡核苷酸：专门为同源重组修复基因敲入开发，具有比标准寡核苷酸更高的稳定性和更高的掺入率，可同时用于Cas9核酸酶和Cas9切口酶。

Alt-R CRISPR-Cas9优势

1、特别优化的crRNA/tracrRNA/sgRNA长度，提高编辑性能

以HPRT基因中的12个位点为靶点，分别使用Alt-R crRNA:tracrRNA、Alt-R crRNA XT:tracrRNA、Alt-R sgRNA，与Alt-R Cas9核酸酶组装成3种RNP，加入2μM Alt-R Cas9电穿孔Enhancer，转染HEK-293细胞，培养48小时后，通过二代测序检测总的编辑效率，结果显示其具有很好的稳定性。

2、化学修饰RNA，增加核酸酶抗性，减少免疫应答和细胞毒性

以HPRT1的12个位点为靶点，分别用Alt-R crRNA:tracrRNA、体外转录（IVT）RNA，转染可高效表达化脓性链球菌Cas9蛋白的HEK-293细胞，24小时后，测定常见应激反应基因IFIT1（A）和OAS2（B）的表达水平。（A）qPCR显示IVT RNA强烈诱导IFIT1，而Alt-R RNA无影响。（B）qPCR显示IVT RNA对OAS2的诱导可测，而Alt-R RNA处于基线。同时IFITM1、RIGI、OAS1等3个应激反应相关基因均得到相似结果，说明Alt-R RNA不会激活细胞先天免疫反应。

3、优化的Cas9蛋白和高保真HiFi Cas9蛋白，提供更高的特异性切割

4、电穿孔Enhancer，提高转染效率，尤其是原代细胞等较难转染的细胞

用0.125μM-4μM RNP（Alt-R crRNA:tracrRNA:Cas9复合体），通过Lonza Nucleofector 核转染K562细胞（A）、Jurkat细胞（B）、HEK-293细胞（C）时，使用电穿孔Enhancer（深蓝色）、不使用（浅蓝色）的编辑效率。

5、HDR Enhancer，提高同源重组修复效率

①提高多种细胞HDR

 以人HPRT为靶点，使用Lonza Nucleofector核转染系统，将4μM RNP（由Alt-R crRNA、Alt-R tracrRNA、Alt-R Cas9组装），加入4μM Alt-R Cas9电穿孔Enhancer，以3μM IDT Ultramer寡核苷酸作为同源重组修复DNA模板，转染人多种细胞系。电转后，细胞培养在含30μM Alt-R HDR Enhancer的培养基中（绿色），或培养在含有DMSO的培养基中作为阴性对照（棕色），HEK-293、HeLa培养48小时，Jurkat、K562培养72小时，通过限制性片段长度多态性（RFLP）、靶序列PCR进行HDR分析，显示Alt-R HDR Enhancer可提高多种细胞类型的同源重组修复效率。

②提高多种基因HDR

以人基因组多个位点为靶点，将4μM Alt-R Cas9 RNP，加入4μM Alt-R Cas9电穿孔Enhancer、3μM IDT Ultramer单链DNA模板，通过电穿孔转染。电转后，细胞分别培养在含30μM Alt-R HDR Enhancer的培养基（蓝色）、含有DMSO的培养基（绿色）、未处理的培养基（棕色），48-72小时后，通过RFLP、PCR进行HDR分析，显示Alt-R HDR Enhancer可提高不同基因的HDR效率。

6、在线CRISPR序列设计工具，方便地设计高质量的crRNA/sgRNA/同源重组修复DNA模板/引物等

如物种的基因组富含A、T，或Alt-R CRISPR-Cas9的位点不适合，IDT同时提供CRISPR-Cas12a系统，尽可能满足编辑需求。

欢迎大家帖子留言讨论！

参考文献：

许元，金玉翠 ， 乐珅  CRISPR 基因编辑的脱靶效应应对策略综述，基因组学与应用生物学，2020 年，第 39 卷，第 6 期，第 2921-2929 页

Bolukbasi M.F., Gupta A., and Wolfe S.A., 2016, Creating and evaluating accurate CRISPR-Cas9 scalpels for genomic surgery, Nat. Methods, 13(1): 41-50

Chen J.S., Dagdas Y.S., Kleinstiver B.P., Welch M.M., Sousa A.A.,Harrington L.B., Sternberg S.H., Joung J.K., Yildiz A., and Doudna J.A., 2017, Enhanced proofreading governs CRISPRCas9 targeting accuracy, Nature, 550(7676): 407-410

Cheng C., Shu P.C., and Peng X.Z., 2018, Advances in CRISPRCas9 gene-editing system, Jichu Yixue Yu Lingchuang (Basic and Clinical Medicine), 38(4): 543-547 (程成, 舒鹏程, 彭小忠, 2018, CRISPR/Cas9 基因编辑系统研究进展, 基 础医学与临床, 38(4): 543-547)

Cui Y., Xu J., Cheng M., Liao X., and Peng S., 2018, Review of CRISPR/Cas9 sgRNA Design Tools, Interdiscip. Sci., 10 (5962): 455-465

Guha T.K., Wai A., and Hausner G., 2017, Programmable genome editing tools and their regulation for efficient genome engineering, Comput. Struct. Biotechnol. J., 15: 146-160

Haeussler M., and Concordet J.P., 2016, Genome editing with CRISPR-Cas9: Can it get any better? J. Genet. Genomic., 43(5): 239-250