T4 连接酶载体连接求助

各位大佬，我在用takara的T4连接酶构建载体，插入片段为1.3KB，两端为单酶切位点，每个保护碱基均为6个还有无保护碱基的片段。对照试验确认载体能够切开。但是，我在做完转化后，菌板挑点做菌液PCR能看到目的片段的条带，但是我在小摇后，在做菌液PCR就没有了。这个是怎么回事呀？求解决方法！

第一次菌液PCR是菌板挑点20μ无菌水稀释，20μ 2Xtaq体系

第二次菌液PCR是小摇菌液，2μ稀释到40μ无菌水中，20μ 2X Taq体系

琼脂糖凝胶 1%的浓度

过夜小摇 2ml/5ml的摇菌管。