小鼠原代肝细胞分离

一、实验动物

小鼠：周龄6-8周，常用品系：ICR、C57BL/6

（PS：越年轻的小鼠分离得到的原代细胞活力越好！）

二、实验器材

留置针、眼科剪、显微止血夹、50ml注射器、医用胶带、弯头镊3-4把、筛网、10cm培养皿5-6个。

三、实验试剂

麻醉剂、HBSS（可购买带酚红商品化HBSS）、无水CaCl₂、EGTA，NaOH、胶原酶、HEPES、IV型胶原酶、DMEM高糖培养基、percoll溶液。

四、实验前准备

1、器械灭菌：将弯头镊、眼科剪、止血夹等器械高温灭菌或浸泡在75%乙醇中过夜。

2、试剂配置：①NaOH溶液的配置：称取适量NaOH配成4mM/L的溶液；②缓冲溶液一：在HBSS中加入EGTA，并用配置好的NaOH溶液进行pH值调整至弱碱性（可用pH计测定，也可用pH试纸测定，不超过8.0）；③缓冲溶液二：在HBSS中加入HEPES和无水CaCl2，调整pH至弱碱性，加入一定量的IV型胶原酶。

将灭菌好的器材转移至超净台中并紫外照射30min，配置好的缓冲溶液一、二放置于水浴锅内进行37℃水浴。

五、实验步骤

1、小鼠麻醉

根据体重计算相应的麻醉剂量并腹腔注射（也可以用异氟烷进行空气麻醉）

2、对完全麻醉后的小鼠进行解剖，打开腹腔，找到小鼠下腔静脉及门静脉，使用滞留针插入下腔静脉，将50-60ml的缓冲溶液一在10-20min内缓慢注射进入小鼠血液循环内，看到小鼠肝脏有明显肿胀时剪开门静脉，完成后改用缓冲溶液二进行冲洗。

3、冲洗完成后，将小鼠肝脏剪下，转移至DMEM高糖培养基，用DMEM培养基清洗2-3次后，使用灭菌镊子将肝脏在培养基内撕开，使原代肝细胞从肝脏内流出。

4、将分离得到的肝脏细胞过筛网筛选，过滤组织碎块及其他杂质，并对细胞混悬液离心，按照一定的离心力得到初步的肝细胞沉淀，此时的肝细胞中混杂着肝脏实质细胞和非实质细胞，需要使用percoll离心液进行梯度离心。

5、梯度离心后的细胞即为原代肝脏实质细胞，重悬后计数即可用于后续的实验，若对细胞纯度存疑，也可以进行流式测定。