基于质谱仪血培养阳性样本病原菌的快速鉴定技术

        血流感染(blood stream infection，BSI)是由于细菌或细菌毒素侵入人体血液引起的感染，主要包括败血症(septicemia)和菌血症(bacteremia)。由于抗生素和激素的使用、有创性诊疗技术的广泛开展以及人群免疫力等因素，近年来血流感染的发病率逐年升高。血流感染连续多年位于疾病死亡种类的前十，其致死率达到 20-50%，全世界范围内每天约有2万人死于血流感染；每小时因为延迟使用有效抗生素增加的死亡率为8.0%。因此，早期、准确地鉴定阳性厌氧血培养瓶中细菌，提高兼性及专性厌氧菌的阳性检出率，对临床正确采取诊疗措施、降低治疗费用、挽救患者生命等非常重要。

        目前对血流感染的病原体检验的金标准依然是血培养，仪器提示血培养阳性后，传统的检验方法是通过涂片初步检验和转种到最终完成鉴定和药敏试验常常需要1-3天时间，无法满足临床使用抗生素治疗的急切需要。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术是一种微生物鉴定的新技术，具有快速、准确、方便的优点。大量研究证实，通过细菌富集技术处理阳性血培养标本后，可直接用质谱进行鉴定，大大提高了鉴定速度，缩短一级和二级报告时间，满足临床快速诊断的需求。这项快速鉴定技术近年得到临床的广泛应用。  

        基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪的结构共分为五大部分，包括进样系统、离子源、质量分析器、检测器及数据处理系统。进样系统是将样品送入离子源的适当部位; 离子源是将样品分子电离生成离子。其基本原理是将样本菌株在离子源电离生成离子，质量分析器[飞行时间分析器(Time of flight，TOF)]通过检测离子在漂移管中飞行的时间来检测离子质荷比(m/z)。离子在漂移管中飞行的时间与离子质量的平方根成正比，能量相同的离子，质量越大，飞行的时间越长；质量越小，所用时间越短。最后以离子质荷比(m/z)为横坐标，离子的相对强度为纵坐标形成分析图谱。质谱仪能够根据样品离子化后形成不同的分析图普，对样品实现鉴定，具有高灵敏度、高通量、能耐受一定量的杂质，对样品的纯度要求不高等优点，可以分析细菌培养液、菌体等非常复杂的生物样品。

        EIGNER等、van VEEN等、SENG等、BIZZINI等的大样本研究和应用表明：利用MALDI-TOF MS能准确快速的鉴定80%～95%以上的临床病原菌单个菌落在这项快速鉴定技术中，菌体富集是快速鉴定阳性血培养标本致病菌的关键。菌体富集的步骤主要包括以下几步：(1)阳性血培养样本的采集；(2)裂解、清除肉汤中的红细胞；(3)病原微生物菌体蛋白质的沉淀；(4)菌体蛋白质提取及溶解。目前菌体富集的方法有试剂盒法和自建法。自建法主要有非离子表面活化剂分离法、分离胶促凝管法、滤膜吸附法、差速离心法和短时相培养法。

        试剂盒法目前市面上有布鲁克的Sepsityper试剂盒、毅新博创Clin-TOF-II MS试剂盒。试剂盒法具有操作易于标准化，准确率高，对革兰阴性菌的鉴定符合率90％，而对革兰阳性菌的鉴定符合率也可达到76％，此外对酵母菌也有一定的鉴定率。

        非离子表面活化剂分离法有皂素离心法和SDS分离法。皂素和SDS属于非离子表面活化剂，可以裂解、清除肉汤中的红细胞。这种方法具有操作简单，速度快，鉴定符合率高。皂素法和SDS法对革兰阴性菌、链球菌、肠球菌都具有很高的鉴定符合率。张蓓与宋冰等使用SDS法和皂素法对临床临床血培养阳性标本病原菌的鉴定符合率超过80%，而且对酵母菌也具有一定的鉴定符合率。此外近年不断有试验发现新的非离子表面活化剂可用于血培养阳性标本的快速鉴定，部分试验发现其鉴定符合率要超过分离胶促凝管法，而且在酵母菌的鉴定符合率要高于分离胶促凝管法。

        分离胶促凝管法就是将分培养瓶内混合液抽取出来后加入到分离胶促凝管后，再通过离心法将菌体分离出来后再上质谱仪鉴定。分离较粗凝固管法的鉴定符合率与试剂盒法相似，成本低，但处理流程比较复杂，但是使用分离胶促凝管法富集菌体后根据细菌种类做相应的技术改良，获得更好的实验结果。此外，由于这种方法成本低等优势，分离胶促凝管法也是目前实验室使用最广泛的方法。

        滤膜吸附法对酵母样菌的鉴定率高于其他的前处理方法，但需要实验室具备过滤装置。差速离心法是前处理中较常见的一种方法，但使用不同的离心转速、菌株富集物等差异较大，较难规范，且操作方法相对繁琐。

        短时相培养法根据使用的培养基的不同分为短时固相培养发和短时液相培养法。短时相培养法是使用分离胶促凝管富集菌体后接种在培养基中增菌4h后再挑取菌体上质谱仪鉴定。短时相培养法鉴定符合率高，但操作比较繁琐。

        在这些菌体富集方法中，应用最广泛的是试剂盒法和分离胶促凝管法。由于试剂盒法由于成本比较高，所以很多实验室选择使用分离胶促凝管法。但是分离胶促凝管法也受很多因素的影响，比如血培养瓶中细菌的浓度，分离富集的程序以及以及实验人员操作熟练程度等。CHTISTNER等利用金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌为模型进行稀释试验发现血培养中细菌浓度10⁷ CFU/mL 为时间飞行质谱仪的检测下限，而细菌浓度达到10⁸ CFU/mL时鉴定效果最优。处理程序中的无菌生理盐水和75%乙醇洗涤次数的不同对分离胶促凝管法的鉴定符合率影响较大。此外试验操作人员熟练程度对鉴定符合率也有较大的影响，国外有研究发现同一种方法不同的试验人员操作会导致鉴定符合率出现较大的波动，而且上质谱仪点板是单孔还是双孔对试验鉴定符合率也有一定的影响。即便如此分离胶促凝管法基于其鉴定符合率与试剂盒法相近，成本低，无需特殊设备的优点被大多数实验室接受。

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