揭秘：16年前的血浆样本还能做代谢组学研究吗？

样本放太久，想做代谢组学研究怎么办？如果您有同样的疑惑，请看下面的文章。

研究背景

临床上研究代谢组学最常用的样本就是血浆和血清，严格的quality assurance，quality control才会保证最终分析结果的可靠性。样本采集，处理，运输及保存都直接影响样本中代谢物的稳定性。临床上，对于生物样本的保存最常用的方法就是液氮保存与低温冰箱（通常是-80℃）保存。然而就安全性与经济性来说，生物样本的长期保存尤其是生物样本库建库更多倾向于-80℃低温保存。因此，对于长期保存在-80℃低温冰箱中的血浆或血清样本来说，代谢物的稳定性及样本质量与保存时间长短的关系需要进一步分析探究。

研究路线

作者招募了3个年龄组的志愿者采集血浆样本，为了减少受试者个体间的差异性对实验结果的干扰，每个受试者都是多次取样。在同一年龄组内，作者分析了不同保存时间段内代谢物含量变化，从而得到stable metabolites和unstable metabolites的种类。然后作者用box plots对selected plasma metabolites的血浆含量进行分析，并用MxP Biofluids Quality Control assay对sample quality进行评估，分析得到long-term storage对血浆样本代谢组的影响。

研究结果

1.长期保存会影响血浆样本代谢组

作者对3个年龄组的血浆样本代谢物含量按保存时间长短进行比较分析发现，检测到的231种代谢物中，有226种在保存时间的前七年中保持稳定；保存11年的样本相比于保存9年的样本，26%的代谢物含量发生了变化（20%的代谢物含量升高，6%的代谢物含量降低）；保存16年的样本相较于保存14年的样本，7%的代谢物含量发生了显著变化，另外有6%代谢物含量发生了降低。虽然大多数类别的代谢物含量都或多或少受到长期保存的影响，但是complex lipids，fatty acids，energy metabolism molecules，amino acids及相关的化合物则表现出对长期保存 highest sensitivity。人血浆代谢组在低于7年保存时间时足够的稳定，但是对更长的保存时间比较敏感。

2.长期保存对血浆代谢物含量的影响

Box plots对选定的部分代谢物含量变化进行分析（红色是70岁组，蓝色是75岁组，绿色是80岁组）

可以看到，长期保存后，精氨酸和甘油酸酯浓度明显上升；天冬氨酸浓度上升，而天冬酰胺浓度下降，表现为天冬氨酸与天冬酰胺比例上调；丙酮酸，半胱氨酸和胱氨酸的浓度下降。

在同一年龄组内，长期保存后，多种溶血磷脂酰胆碱，C 18:2, C 18:1, C 18:0, C 24:0均表现出浓度增加，但是数种磷脂酰胆碱尤其是包含不饱和键的C 20:5, C 20:4浓度减少。

几种脂质氢过氧化物，甘油三酯（TAG）氢过氧化物和胆甾醇酯氢过氧化物都表现出随保存时间延长而浓度增加。值得一提的是，在同一年龄组内，大多数保存超过七年的血浆样本中脂质氢过氧化物浓度显著增加。

3.长期保存影响样本质量

为了进一步验证代谢物浓度的差异与长期保存相关，作者使用MxP Biofluids Quality Control assay对样本质量进行评价。

几乎所有的样本都有很高的MxP Blood Processing Control Score，表示高质量的血液样本收集和处理；相比之下，作者发现，MxP Blood Processing Control Score随着样本保存时间的延长下降，例如，97%的保存时间少于四年的样本显示出high-quality score，而100%的保存时间介于14年与16年之间的样本显示出low-quality score。这些结果显示，延长-80℃保存时间影响样本质量，代谢物的浓度变化与保存时间有关，而非样本处理。虽然记录显示，EDTA血浆样本一直保存在-80℃环境中，但是quality score的普遍下降也可能是因为保存与运输过程中温度上升，以及血液和血浆样本处理时间过长。

研究结论

用标准化的方法收集处理样本是弱化及排除confounding factors的影响，从而实现bench to bedside转化研究目标的关键。我们已经证实，长期保存主要影响人血浆样本中代谢物的稳定性，从而影响代谢组学研究的数据分析。在这种背景下，研究结果显示，代谢物分析适合于在数据分析之前对低质量样本的鉴定。虽然当保存时间在7年内，几乎所有被检测的代谢物在-80℃环境中很稳定，但是基于冰冻样本的biomarker研究最好还是在采样后尽快进行。