对于原发卵巢功能不全患者，如何改善卵巢储备及体外受精结局呢？

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Effects of intraovarian injection of autologous platelet rich plasma on ovarian reserve and IVF outcome parameters in women with primary ovarian insufficiency 

Yigit Cakiroglu1,4, Ayse Saltik1, Aysen Yuceturk1, Ozge Karaosmanoglu1, Sule Yildirim Kopuk1, Richard T. Scott Jr.2,3, Bulent Tiras1,4, Emre Seli2,5 

一. 什么是原发卵巢功能不全呢？

根据Human Reproduction and Embryology (ESHRE) 的对 primary ovarian insufficiency (POI)的定义是

 ((i) oligo/amenorrhea for at least 4 months；少经或闭经至少4个月以上

(ii) an elevated serum FSH >25 IU/l on two occasions 4 weeks apart；两次检查，间隔4周FSH >25 IU/l

(iii) onset before the age of 40 years)；发病时间在40岁之前

卵巢老化是一个生理性过程与卵子数量、质量和卵巢卵泡储备下降相关。年龄与生理性卵泡数下降对生育有重要影响，并且使越来越多妇女寻求生育治疗的原因。事实上，在美国，诊断卵巢储备减少(DOR)的女性接受辅助生殖技术(ART)治疗不孕的人数从2010年的22089人增加到2017年的40883人。原发性卵巢功能不全(POI)的极端形式，影响1%的育龄妇女，其特征是40岁前卵巢储备严重下降，导致更年期血清促性腺激素水平和月经不规律或闭经。

二. 目前对POI患者治疗的方式有哪些？

目前，捐赠卵母细胞是唯一确定的治疗POI女性的方法。与诊断为DOR的女性的趋势类似，美国接受卵母细胞捐赠的女性人数从2010年的15504人增加到2017年的21033人[2,3]。尽管卵母细胞捐献的使用持续增加，但许多妇女表示难以适应不生育携带自己基因物质的孩子的想法。对卵母细胞捐赠的另一个障碍是，一些国家出于伦理或宗教考虑对使用捐赠卵母细胞有限制，迫使妇女寻求实验疗法。

目前，对于那些希望用自己的卵子生孩子的POI妇女，还没有有效的治疗方法。虽然已经测试了许多实验策略，但在患有POI的妇女中，活产是很难实现的。Kawamura等人进行了Hippo通路中断和Akt活化[8]的研究。首先，他们摘除了患有POI的女性的卵巢，并冷冻保存卵巢皮质条。然后，他们将这些卵巢条带分离，破坏Hippo信号，刺激Akt信号，然后将碎片移植回卵巢。在第一个使用这种方法的研究中，有27名妇女参与，他们报告说在体外受精(IVF)和胚胎移植后活产。在同一组的随访研究中，37例POI妇女中，9例在自体移植中实现了卵泡生长，6例进行了卵母细胞提取，4例进行了胚胎移植，导致2例活产(5.4%)[9]。实验性治疗模式也被用于患有DOR的女性。Herraiz等人研究了自体干细胞卵巢移植(ASCOT)对不良反应[10]患者卵巢储备的影响。在本研究中，骨髓源性干细胞(BMDSC)被动员到外周血粒细胞集落刺激因子(G-CSF)处理，然后通过收集，细胞通过动脉导管进入卵巢动脉。17名妇女接受了治疗，导致窦卵泡和卵母细胞数量增加，5名妇女怀孕，其中3名是自然受孕的。虽然ASCOT是一个复杂的程序，但他们的研究对于骨髓或血液源性物质对卵巢储备有限的女性卵泡发育的潜在影响是令人鼓舞的。

三.本研究的目的

希望使用POI患者自体的富含血小板的血浆进行卵巢注射，改善卵巢功能和IVF结局。而这项技术比复杂的卵巢手术要简便一点。

血小板的作用：富血小板血浆(PRP)是由血浆中高浓度血小板组成，由采集外周血离心取得。血小板含有800多种蛋白质分子、细胞因子、激素和化学引诱剂。血小板的活化可诱导多种生物活性蛋白的释放，从而刺激细胞增殖、生长和分化。活化血小板释放的生物活性介质包括血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)和肝细胞生长因子(HGF)。PRP可促进血管生成和合成代谢、炎症控制、细胞迁移、分化和增殖[15]。自体血小板已被用作组织愈合和再生的蛋白质来源，并已被建议促进发育分离的人原始和初级卵泡的发育到前腔期。

四.本实验的主要操作方法、实验人群及结果

实验人群：符合ESHRE标准且入选标准为年龄< 40岁，>不孕病史1年，至少有一个卵巢。排除标准为:有恶性肿瘤病史、遗传性卵巢功能不全、曾做过重大下腹部手术导致盆腔粘连、禁止使用血浆输注抗凝药物、目前或既往缺乏IgA。

血小板制备方法

PRP制备方法为离心分离血小板血浆。在无菌条件下采集约20ml血液样本，使用T-lab自体血小板血浆试剂盒(T-Biotechnology Laboratory, Bursa, Turkey)按照说明书制备PRP。简单地说，采血后，830 g离心8分钟。然后，将一根16g的针与一个5ml的注射器连接，并向前推进到血清层。旋转针尖收集PRP。从第一管中收集大约2- 4cc的PRP后，对第二管进行类似处理(共收集4- 8cc的PRP)。收集的溶液转移到再悬管中，轻轻摇晃30s-1 min。

注射方法：

当天，在超声引导下，在镇静麻醉下，经阴道用35cm 17g单腔针注射至少1个卵巢。注射至从皮层到皮层下和间质区。虽然对于患有POI的女性有小的纤维化卵巢，使卵巢内注射2- 4ml PRP具有挑战性，但这是通过扩张实现的，可能是通过创造新的平面和在卵巢的多个部位注射。术后患者被带至恢复室观察30-40分钟，当天出院回家。

 注射时间：

PRP注射的时间随机选择在闭经的女性中，而在报告月经稀少的女性中，PRP在月经出血结束后10天内注射。在注射PRP前，于同日测定基线窦滤泡计数(AFC)、血清抗苗勒氏激素(AMH)和卵泡刺激素(FSH)水平。

PRP注射后，闭经和月经少的妇女都被随访管理6周，允许自然怀孕或月经。那些6周没有月经出血的人进行了妊娠测试，(如果没有怀孕)月经激素诱导(2x (2 mg戊酸雌二醇)5天，2x (2 mg戊酸雌二醇+ 0.5 mg norgestrel) 5天(Cycloprogynova, Bayer))。如果下一个月经周期的月经延迟，则重复同样的策略。在PRP术后第2个月经周期的2-4天，重新评估AFC和血清AMH和FSH水平。那些在这一点上发现有腔卵泡的患者开始接受控制性卵巢过度刺激(COH)治疗，而那些没有被发现的患者则进行了长达6个月的月度随访，并在出现腔卵泡时接受了COH治疗。在每次评估之后，没有出现腔卵泡的患者接受循环雌激素和孕激素治疗(2 mg戊酸雌二醇10天，2 mg戊酸雌二醇+ 0.5 mg norgestrel 11天(Cycloprogynova, Bayer))。这样做是为了便于调度和控制周期进度。

 如果在超声检查中发现基线没有任何腔卵泡的妇女至少有一个腔卵泡，或者AFC比基线测量值增加，或者AMH增加，或者妇女血清卵泡刺激素水平下降，则认为PRP阳性反应。

被发现至少有一个腔卵泡的妇女(即使数目不多但高于prp前的评估)开始对IVF-ICSI进行卵巢刺激。在AMH增加或FSH减少，但与基础测量相比没有窦卵泡的情况下，不进行刺激。

给予rhCG 34 h后经阴道超声引导穿刺取卵母细胞。取出后4小时进行卵母细胞剥离，所有女性均行ICSI。根据患者和医生的意愿和建议，在卵裂期将优质胚胎冷冻保存，或在超声引导下移植卵裂期第3天或第5天的囊胚。

 结果

注射PRP后23位女性（7.4%）自然受孕，201（64.8%）窦卵泡数增加并尝试IVF，87位女性（27.8%）无窦卵泡她们也没有再进行其他治疗。在201位女性尝试IVF中，82位（26.4%）有胚胎；其中25人将胚胎冷冻后下周期移植，而57位女性进行新鲜胚胎移植，其中13位怀孕（妊娠率为22.8%/每移植周期，为4%/占总数）。总体上讲，这311位女性进行PRP治疗，25位（8%）冷冻胚胎。