慢病毒包装详细教程（包装效率提高策略、病毒浓缩、滴度测定和保存）
科研无止尽、yj1984ren 2人推荐应小伙伴需求，来写一个慢病毒包装的详细策略，希望能帮助到正在进行这项实验的小科学家们；如有错误，希望大家积极指明，纠正错误是非常好的自我提升方式。
我将从以下六点切入，做一个较为详细的总结，大家可以根据自己的需求跳到相应的版块进行参考。需要提醒大家一点，你通过各种途径获得的实验流程不一定能完全复现，需要结合自己实验室的器材、原料、实验环境及实验人员做优化，最终使其变成适合你自己的东西。后面我会出一个非人为参数对实验结果影响的总结帖子，供大家参考。
慢病毒包装原理
慢病毒包装材料
慢病毒包装步骤
慢病毒滴度测定
慢病毒浓缩流程
慢病毒保存措施
一、 慢病毒包装原理
“做实验不知道原理，出了错误就不知道如何修正。”------尼古拉斯 杰哥
我们实验室使用的3质粒系统，PxpaX2、PMD2g、以及PLVX载体的质粒。如图，各个载体载体在慢病毒包装中的作用：
问：为什么不将所有组分整合到1-2个质粒上？
答：慢病毒包装系统所产生的的病毒颗粒，一般不具有自主复制能力！由于单个载体在病毒产生过程中，会更容易发生基因重组，从而产生具有自主复制作用的RCV(replication competent virus,具有自主复制能力的病毒)；RCV具有增殖优势，不仅会降低你目的病毒的产量，同时会产生一些安全性问题。
二、 慢病毒包装材料
1，健康的HEK 293T细胞，一般使用复苏后10代以内的细胞进行慢病毒的生产，要求无细菌、真菌以及支原体污染；
2， 转染试剂，如PEI、Higene、lipo两三千之类（哈哈哈开个玩笑，lipo2000或者lipo3000）？
各种转染试剂的步骤稍有差别，本文以PEI为转染试剂。
3，DMEM无血清无双抗培养基、DMEM完全培养基（10%FBS和1%P/S）；
4， 10mL无菌注射器(环氧乙烷灭菌处理)；
5， 0.45μm的细菌滤器。
三、 慢病毒包装步骤
好了，到了大家最想看的环节了，我以10cm dish体系为例。实验步骤我会精确到每一步的时间点，可以先跟着这个时间点做一次，然后根据自己的实验调整。
Day 1 （7:00 PM）
铺板HEK 293T细胞
数量：400万/10 cm dish ；觉得计数麻烦的话，可以在293T细胞长到约90%汇合时，1:5传代（均分成5份），每1份的数目差不多就是400万了。
Day 2 （3:00 PM）
三质粒转染
在培养箱中恢复细胞状态约20h，此时可进行转染。
基础知识：
三质粒的转染体系三种质粒的配比有许多种方式，我个人目前在用的为4:3:1的比例，即PxpAx2：PMD2g：PLVX(载有你基因的质粒)。
10cm dish一般转染质粒的总质量为20μg，PEI的量为质粒的2.5-3倍（也就是50μg-60μg，一般推荐按照2.5倍来）。按照比例算下来，PxpAx2：PMD2g：PLVX的质量比为：(7.5μg:2.5μg:10μg)
小贴士：在提到质粒的量时，千万记得说质量而不是浓度，不然容易出错。
实验步骤：
- 取如上总质量为20μg的质粒添加到总体积500μL的DMEM无血清无双抗培养基中，记为A液，移液枪混匀20次；
- 取PEI(一般配置成1μg/mL)50-60μg（也就是50-60μL）添加到总体积500μL的DMEM无血清无双抗培养基中，记为B液，移液枪混匀20次；
- 将B液逐滴滴加到A液中，移液枪轻柔混匀66次，室温静置15-20min；
- 将静置好的转染试剂（A+B）缓缓滴加到恢复状态20h的HEK 293T细胞中。
- 做好标记，记好转染时间、转染质粒、换液时间等参数提高实验重复性。
Day 3（9:00 AM）
换液
转染后的第18h，将含有转染试剂的HEK 293T上清更换为10mL DMEM完全培养基；对于新手，为了防止你在换液时将细胞吹散，可以留3mL的液体在dish中，更换8mL DMEM完全培养基。
Day 4 （3:00 PM）在转染后的48-72h，为病毒生产的高峰期，一般我们收集转染后48h（换液后30h，产毒30h）的病毒液用于实验，足以满足大部分实验需求。
收集病毒于15mL tube中，500g，5mL离心去细胞碎片和杂质，随后使用注射器和滤器进行过滤。收集后的病毒上清可以用来进行感染和储存。
四、慢病毒滴度测定
病毒滴度的单位为：TU/mL，代表每毫升病毒液中具有转导功能的病毒颗粒的数目。
计算公式为:滴度=（感染时细胞数（个）*阳性细胞%）/病毒液体积（mL）
>>>感染时的细胞数为用病毒液感染目的细胞那一时刻的细胞数，而非接种时的细胞数；
>>>具有转导功能是指该病毒颗粒具有能整合到靶细胞基因组的能力。
病毒液体积和感染时细胞数已知，需通过流式细胞术确认阳性细胞百分比。
滴度测定常常使用HEK 293T细胞，对的工具人，哦不工具细胞！
大致的原理为，将在第三部分收集到的病毒上清，按照梯度添加到293T细胞中，感染后48h检测阳性细胞的比例，从而确定病毒的滴度。
以下为我在进行滴度测定时，所整理的数据，大家可以作为参考：
五、慢病毒浓缩流程
慢病毒浓缩的需求常常来自于感染原代细胞，因为原代细胞通常比较难感染。浓缩可以提高病毒的滴度，也就是单位体积内病毒的个数，使用人海战术来感染目的细胞。
原理：超速离心
参数:30000g,1.5h; 离心机升速9降速3（低制动为了防止离心机在减速过程中造成颠簸扩散到伤情中，会降低浓缩效率）。
离心完成后，小心弃掉上清，加入原始病毒液1%体积的培养基或PBS重悬病毒颗粒。
六、慢病毒保存措施
对于病毒液，不论是浓缩前还是浓缩后，直接置于液氮中速冻后存于-80℃冰箱保存；-80℃保存的病毒再次融化大约损失一半的病毒颗粒；
也可以暂时存放于4℃冰箱，存放1周内，病毒滴度不会有很明显的变化。
总结
以上就是我在包装慢病毒时的经验了，里面肯定有许多不完善的地方，还请大家批评指正，一起进步哈！
对293T细胞和铺板基础感兴趣的同学，可以点击我以前的文章;
最后编辑于 2022-10-09 · 浏览 2.8 万
