western Blot犯错集锦

第一次 

敷抗体应该用水平混匀仪而不是封闭时用的左右混匀仪。

转膜2.5h有点转过了，marker很淡。

第二次 蛋白样品上过loading buffer了，我又多上了。

边孔效应我没注意，最左的孔上了loading buffer。

第三次 板子没放平，漏胶了。还有插梳子把国产板插裂了。

第四次 1.5mm的板子，样本最多加15ul，不是20ul。跑电泳时，电泳槽内外面搞反了，凸面朝内。

还有转膜前要用转膜液湿一下滤吗？赶下气泡。条带有气泡是因为凝胶和膜之间有气泡。

孵抗体拿个架子，不要一只手拿太多。

红色条带剪中间不是下边。

因为要分装2抗，脱脂奶粉配50ml，多些，不是10ml。

结束提示，转膜时没滚动造成气泡。

第五次 加下层胶时，应从最左边加，否则最左边会凹进去。

转膜，差点忘了加冰袋。

一抗忘分装了，用完了？！明天把二抗以最低比例赶紧分装。

多快好省，没告诉我怎么剩抗体，只告诉我怎么做好wb。一抗比液体黄金还贵！

第六次 这次电泳要跑2个半小时，转膜2个半小时。marker5ul。

第七次 拔梳子拔歪了。还有上样的时候慢点加，伸到里面加，别溢到其他孔。

第八次 抗体加到手指里算了，否则又漏了，无法回收了。

第九次 背景脏 稀释二抗，增加封闭液浓度和封闭时间。还有TBST洗涤4次，每次10分钟，现在看来多洗洗果然有好处。

第十次 蛋白加热100度 5min。

第十一次 竟然切右边的胶变成切左边的胶，重做，口诀为留右保左。marker是歪的，原因俩，第一配置的胶没有混匀，第二，缓冲液有问题。这样出来不仅marker是歪的，连样品也是歪的。。。巨难看，还有样孔尽量平整。

第十二次 组装三明治前，转膜平衡液20分钟，降低sds浓度，避免小分子量蛋白转过。勿用手触摸印迹膜。

第十三次 我安装三明治时，在水下，胶和膜斜了，转出来少条带了。

第十四次 胶吹打8次，把胶混匀。二抗一定要用牛奶。

背景脏

先说这个实验总体的背景，有黑点，这种背景非常像封闭液没有完全溶解带有杂质，或者是容器没洗干净，有脏东西了，最好把封闭液用0.22um的膜过滤一下再做。然后其他器皿都洗刷干净。洗液里面加点tween试试。

背景比较高的解决方法:1)降低1、2抗浓度,我们用的晶美的2抗稀释度甚至达到了

1:20,000（1:1000减少为1:10000）;2)延长洗膜次数和时间;3)降低曝光时间（3min减少到10sec）;

背景过高，可能封闭没封闭好，也可能抗体质量不好所致。抗体里加封闭液，稀释液和封闭液各一半试试。

目的蛋白浅，显影液孵育时间长些，多抱几次。

actin清楚，可能mtor浓度太高。

二抗室温减为45min。

1.洗膜不充分，增加洗涤液的体积和洗涤次数；在洗涤液中加入Tween=20。

2.二抗浓度过高，引起了一些非专一性的抗原-抗体相互作用，适当降低二抗浓度，可以分梯度进行。

3.二抗的识别抗原免疫簇不唯一，这是因为二抗是多克隆抗体，使用单克隆抗体的二抗，此时二抗的识别抗原免疫簇是唯一的，其非专一性的抗原-抗体相互作用会大为减少。当然，有时，单克隆抗体也会有识别抗原免疫簇不唯一，如果两种蛋白质的抗原免疫簇的结构很相近的话。如果不知道是不是二抗的识别抗原免疫簇不唯一，可以不加一抗的情况下只加二抗实验，可以检测出是否为二抗的的抗原免疫簇的识别的原因，若是的话，可以先更换封闭试剂，若无效，则要同时更换二抗。

4.封闭不充分，增加封闭液的封闭时间，适当提高温度，更换封闭液。

5.曝光过度，缩短曝光时间。

6.检测过程中膜干燥，保持充分的反应液，避免膜干燥。

7．若无别的选择，可尝试选择5%的脱脂奶粉，同时加入Tween=20。

8.滴定一抗或二抗的效价，找到一个产生清晰的信号强度可以接受的较低的抗体浓度。

蛋白样品用40ulripa，10ul 5*loadinbuffer，每次样品15ul（可以用3次），吸1ul测蛋白浓度。

6孔板6个孔，3000r 5min收细胞。13000r 15min，吸上清，取1ml测浓度。100度10min

凝胶凝固大约半小时。

分装抗体

1.收到后，请务必在12000rpm离心1-5min后再打开管盖进行分装和保存。

2.对于大部分抗体，比较合适的是分装成1次使用量，用不完放到4摄氏度避免反复冻融，冻融一次抗体都会效价降低！！。（不少于10ul，分装体积越小，抗体浓度越可能会受到蒸发和管壁吸附的影响。）保存在-20摄氏度。