293T细胞状态识别与状态恢复（各种污染的处理办法）！！！

啊。。实验缠身更新的有点晚了

HEK 293T细胞的背景知识我就不再多做介绍了，有很多大佬的帖子里已经写得很清楚了。有几个小点点，我在此强调一下：

1， HEK 293T细胞属于人源细胞（源于人胚肾上皮）；

2， 表达人源的细胞会比鼠源的好一些（当然具体要看你用的什么载体或启动子）；

3，细胞尺寸（消化后）直径大约在20μm，完全伸展开宽度差不多能增加5倍；

好了，现在开始进入正题来介绍该细胞的状态识别和状态恢复：

一、状态识别

当你新拿到1株细胞后，正确的做法：1. 识别细胞；2. 扩增冻存；3.状态检测。

以上3点其实有一定的顺序性。

首先来讲识别细胞，可以将你培养的细胞在完全贴壁后进行拍照与如下两个网站中公布的照片进行比对，以确定你用的细胞就是你想要用的细胞，曾经有隔壁实验室将其他细胞系当成293T细胞用了2年，后来的学生越用越不对，后来测序才知道不是293T：

常用网站：ATCC https://www.atcc.org/

中科院细胞库 https://www.cellbank.org.cn/xibaoximulu.php

如下，为293T的ATCC官网美颜照片：

以下，是我自己拍的照片，稍微有点密了，但可以看到形态没有很大区别：

扩增冻存

扩增冻存指的是，从别人那里拿的或者是从网站上购买的细胞，你在拿到手后为保证实验的延续性（细胞的状态）而对初次拿到的细胞进行保存，至少得保存2-3个10cm dish的细胞保种种！但有一点，你初次拿到的这株细胞的状态得好，要是师兄给你的细胞半死不活的，叫他重新给你一盘，他可能是在培养你辨别细胞的意识：）

状态检测

一般健康的细胞边界清晰，细胞细胞间无任何杂质，可以理解为细胞白白胖胖的，其实养的多了，状态好不好一眼就能看出来。

细菌污染的细胞其实很好辨别和处理，有以下个点的细胞很可能已经被细菌污染了：

1， 细胞间有许多细沙状的悬浮物，放大到最大倍数可看到短棒状或球状黑点；

2， 培养基基本在看到现象后24h就变黄（DMEM）;

拯救方法：不建议拯救，非要救的话，将Media换成10x双抗的Media（污染细胞专用），处理24h，随后弃掉培养基，换成2x双抗的media，污染不严重的话传个几代应该就可以用了。但是，你敢用吗。。。

霉菌污染

培养基倒不会很快变黄，但能明显的看到菌丝（丝状悬浮物），一般霉菌污染的话比较难处理，建议直接丢弃；你要是强行想拯救，可以加制霉菌素或者两性霉素处理。

两性霉素链接。这种抗生素的东西一般都是小浓度预防，大浓度清除。

支原体污染

支原体污染的细胞其实比较难辨别，一般不严重的污染也不太会影响细胞的状态和形态，但是你要是用支原体感染的细胞上小鼠的话，可能会把小鼠打死。或者要是做得免疫相关的小鼠实验，做出来的数据你敢要吗？

支原体检测的protocol我将另开帖子详细描述，传送门在这里：

支原体检测和清除办法

二、 状态恢复

污染的状态恢复其实上边已经讲了一些，接下来主要讲一些在没有污染的情况下怎么恢复细胞状态。因为不光是污染，你的一些操作其实也很影响细胞的状态的。

1， 胰酶消化过度：293T的消化条件一般为胰酶（0.25%）1mL，37℃培养箱处理45s-1.5min；

问：要是不小心消化了15min怎么办？

答：其实问题不大，比如你消化后要1:5传，现在换成1:4传代就好，放24h差不多就好了。

2， 2天没管细胞长得太满培养基已经黄了

这种一般1:3（多一点）传代，每1.5天传代1次即可很快恢复。

3， 我的细胞看起来“很瘦”（相比之前）怎么办

可以参考“2”的处理办法，不行的话需要重新复苏。

先去吃饭了，暂时先写这么多，希望能帮助要刚进实验室的小伙伴们。