细胞实验入门之细胞活力检测——MTT

检测细胞活力是细胞实验的基础，用来检测药物敏感度，重复性也较好，是一般实验的基础研究。我一般是先大量筛选药物，再针对一次阳性的药物进行三次重复性实验，通过该实验，筛选出合适药物，合适的给药剂量。这是其他实验的基础，一定要结果准确，重复性优秀。所以其中有很多的细节问题，现在把我的经验总结一下，希望可以抛砖引玉~期待大家有不同的新花样出现啊~

一、MTT原理

（MTT商品名，原名太长了，就不写了）噻唑蓝 经过活细胞中的琥珀酸脱氢酶的催化，可以还原为蓝紫色甲瓒结晶，而死细胞无法发生此反应。经过DMSO溶解，检测溶液在490nm 的光吸收值（有的试剂盒检测570），相对得出活细胞数量。

二、实验过程：

1 接种细胞。

接种密度需要进行条件筛选，线粒体丰富的细胞，活力好的细胞，可以密度低一些。线粒体少，活力不太好的细胞，密度就高一些。所以有一些文章中MTT的实验就无法重复，很大原因是由于每个实验室里的细胞状态不同，传代次数也不同，建议使用15代以内的细胞。不要一支细胞一直用，最后细胞都变异了，实验无法出结果，原因竟然在实验基础材料上。

实验检测溶液发黑(OD>0.8)，或者浅浅的颜色（OD<0.2）,都会对结果产生误差，也是细胞接种密度不合适导致的。所以一般控制正常组的OD在0.6~0.5之间，杀伤力如果在30%，模型组OD就在0.35~0.42左右。

2 检测过程

（1）MTT配制：

MTT干粉50 mg，加入10 mLPBS溶解，进行避光超声溶解1min，使用0.22μm 过滤器过滤除菌，保存于4℃避光环境中，贮存液备用1周。

我一般是现配现用。尽量使用新鲜的MTT溶液，我试过4摄氏度保存7天 ，是没有问题的。

（2）吸除含药上清。

如果是贴壁细胞，且贴壁性还较好，就可以使用排枪或者废液泵。如果此时细胞状态已经不是太好，建议使用1ml注射器单独移取。如果是半悬浮细胞，或者悬浮细胞，请离心后再吸除。

这一步是要排除外加药物的影响，有一些药物会和MTT反应，或者会产生沉淀，所以一定要吸除含药培养基，同时也是终止给药实验。

（3）加入MTT检测液。

每孔换用含10% MTT的新鲜培养液200 μL，37℃进行孵育4h。

此时我使用的培养液是不含血清的。

（4）吸除废液。

采用1ml注射器，每孔单独吸除废液，尽量不要贴到孔壁和孔底，可以在预实验的时候练一下，吸除培养上清后，在显微镜下看一下，如果注射器针头吸到了孔底，会看到紫色结晶缺失了一块。

这一步非常影响结果，一定要多加注意。

（5）加入DMSO终止实验反应。

迅速在每孔中精密加入150 μL的DMSO。

单独每孔加液，因为我们实验室的排枪加液会有误差，建议大家也单独加液，整个加液过程控制在5min以内，时间不宜过长。

（6）上机检测

选择490 nm检测波长，震荡10 min充分溶解甲瓒结晶，进行各孔吸光度OD值检测。

检测波长与实验试剂相关，有的试剂会在570nm检测。可以观察一下哪一个波长的光吸收值变化比较敏感，选用哪里波长进行检测。

（7）计算结果

细胞存活率(%)= (OD实验组/OD对照组)×100%。

一般采用相对法，以对照组为基础值，每组进行比较。

然后就是重复实验啦，重复3遍都是阳性，结果就是很可靠的啦，祝大家实验愉快顺利~