关于乳大鼠原代心肌细胞提取

最近在做原代乳大鼠心肌细胞的提取，进行了几次，主要问题是CF获得与生长较好，但是CM的贴壁效果比较差，所以想请各位大佬指点一下。步骤如下：3-5d的乳大鼠，剪下心脏，冷D-HANKs液冲洗，剪碎后胶原酶II（200U/ml，索莱宝）消化5分钟，弃去上清，然后开始逐次消化15分钟一次，取上清加含血清的培养基终止消化后，剩余组织重新加10ml胶原酶II继续消化液，重复8次，后将所有获得的上清离心，加入CM培养基重悬，过筛200目，后置于中瓶差速贴壁1.5h，后细胞悬液计数，按照6*10^5个/孔种六孔板，48h后观察细胞贴壁数目大约在30%-50%左右，有搏动。CF细胞生长良好。

自我反思：1.我在消化过程没有磁力搅拌器，就是自己每间隔5分钟进行摇晃，而且我的消化的上清是装着小培养瓶里进行消化的（放离心管怕把细胞缺氧了。。不知道有没有影响），每次消化后获得上清加入培养基中和也是先放在一个小培养瓶中暂存。

2.没有用明胶铺板，这个是因为我看到圆子里有说不用明胶也可以贴壁，就没有用一是偷懒二是怕污染。

3.还有就是我在消化的过程中自己对消化中的组织晃动感觉有点剧烈，就是左右频繁的摇晃，培养基都起泡沫了，这个对细胞的影响是否比较关键？

4.还有就是我消化的总共是进行了8次，最后组织没有完全消化干净，变成了一整团的絮状物，我就直接扔掉了，我是不是应该把他们全部消化一点都不剩才可以？

5.还有一个小疑问就是，我每次都是加10ml的胶原酶II进行消化，但是我有时候提取乳鼠心脏数量不同，大家有没有经验平均一个心脏要用多少的消化液比较合适呢？

6.还有就是总共的消化时间是多少才合适呢，就是第一次消化获得的细胞暂时静置时间过长会不会对细胞有损害呢？