以circRNA为例解读小分子RNA的研究套路

9月份马上就要过去了，下半年很多人就要开始为明年的课题申报做准备，之前和大家一起读了一些基础研究的文献，因为国自然主要还是支持基础研究，所以后面会继续跟大家解读一些基础的研究热点。因为水平有限，我不是专门搞基础研究的大牛，在跟大家一起读文献的同时也是在自我学习，难免有理解错误之处，也希望大家多多谅解，欢迎批评指正。

今天分享的内容是关于小分子RNA，小分子RNA包括miRNA、LncRNA、circRNA以及ceRNA机制一直是基础研究领域的研究热点，我们可以看看目前比较热的circRNA中标项目是逐年增多的。

今天我们就来读一篇ciRNA的文献，在读之前我们首先了解下什么是circRNA。

circRNA是一类新的具有调控功能的非编码RNA，具有闭合环状结构，大量存在于真核转录组中。大部分的环状RNA是由外显子序列构成，在不同的物种中具有保守性，同时存在组织及不同发育阶段的表达特异性。由于环状RNA对核酸酶不敏感，所以比线性RNA更为稳定，这使得环状RNA在作为新型临床诊断标记物的开发应用上具有明显优势。

circRNA的生物学功能主要包括：

1. miRNA sponge：富含miRNA结合位点来充当miRNA海绵作用，阻止miRNA在3′ 非翻译区与mRNA相互作用，进而间接调控miRNA下游靶基因的表达。

2.调控蛋白结合：通过与mRNA调节的结合蛋白（RBP）结合，进而改变剪接模式或mRNA稳定性。

3.调控基因转录：与RNA聚合酶Ⅱ相互作用并调节转录，或者EIcircRNA可与小核糖核蛋白互作用，再与RNA聚合酶Ⅱ结合。

4.编码功能：有部分circRNA可被核糖体翻译并编码多肽，进而行使调控功能。

今天读的这篇文献题目是：PRMT5 Circular RNA Promotes Metastasis of Urothelial Carcinoma of the Bladder through Sponging miR-30c to Induce Epithelial–Mesenchymal Transition. circPRMT5通过海绵吸附miR-30c诱导上皮间质转化促进膀胱尿路上皮癌转移。2018年发表在Clinical Cancer Research，影响因子10.107分。作者来自中山大学谢丹课题组。

PDF全文已经上传到网盘，公众号后台回复“文献精读”获取全文。

来看前言：

在前言中作者交代了这个研究的研究背景，用了5段话，主要包括：1.膀胱尿路上皮癌（UCB）的流行病学，指出目前还没有治疗UCB转移的特效药。2.介绍circRNA的基本知识和相关研究；3.介绍circRNA在肿瘤中的研究进展，其中提到circRNA参与UCB上皮间质转化（EMT）的分子机制是未知的。4.介绍外泌体和其分泌的circRNA，指出UCB病人的血液和尿液中外泌体的数量明显上升，研究UCB病人的外泌体包含的circRNA及其分子功能，具有重要的临床意义。5.提出研究假说：circPRMT5吸附miR-30c促进UCB细胞迁移和EMT。

方法部分很简单，样本主要来自中山大学肿瘤中心接受放射状膀胱切除术的119例UCB患者，收集了UCB组织与邻近正常膀胱组织,做了表达谱分析。同时做了UCB转移的动物模型（用的4周大的BALB/c裸鼠）和体外UCB细胞培养。统计用SPSS、GraphPad Prism和R软件完成，做了t检验、生存分析（Kaplan-Meier曲线和logrank检验）、相关分析（Pearson相关检验）。

结果部分：

1. circPRMT5在UCBs中过度表达，与患者预后不良相关。

A、火山图比较了UCB组织和邻近正常膀胱组织circRNAs表达倍数的变化。B、三种人体正常组织中组织特异性圆环的聚类热图。

C、UCB组织中circPRMT5的表达倍数与相邻正常膀胱组织（左）相比的表达倍数变化；以及在有淋巴结转移的UCB组织中与无转移组织（右）的circPRMT5表达倍数变化的PCR分析。

D、circrMt5低表达和高表达的UCB患者的生存率。

E、确认circPRMT5是一个circRNA。

F、分别在有或没有RNase R处理的情况下，用探针分别与第7外显子（左）和第7外显子5-外显子5连接（右上）杂交的探针对circPRMT5和PRMT5转录物进行Northern杂交分析。

G、 细胞质和细胞核mRNA实验表明，circPRMT5主要位于细胞质中。

H、 具有代表性的circPRMT5的FISH图像，显示circPRMT5定位于细胞质中。

2.沉默circPRMT5 RNA可抑制UCB细胞的侵袭。

A、示意图显示了两个靶向sh-RNA。上述两种shRNAs处理的UCB细胞中circPRMT5和PRMT5 mRNA表达。

B、PCR检测转染对照载体或circPRMT5过表达质粒的UCB细胞中circPRMT5和PRMT5 mRNA表达。

C、划痕实验显示，敲除circPRMT5可抑制UCB细胞的迁移能力。

D、划痕实验显示，过度表达circPRMT5可促进UCB细胞的迁移能力。

E、侵袭试验显示，敲除circPRMT5可抑制UCB细胞的侵袭能力。

F、侵袭试验显示，过度表达CircrMt5可促进UCB细胞的侵袭能力。

G和H、分别将circPRMT5 shRNA（G）或circPRMT5（H）高表达的对照慢病毒分别注入BALB/c裸鼠静脉内6周。肺（左）、转移结节（箭头所示）和肺转移病灶的苏木精伊红（HE）染色的图像。

3.circPRMT5激活SNAIL1通路诱导UCB细胞发生EMT。

A和B、Western blot分析比较circPRMT5沉默（A）和circPRMT5过度表达的UCB细胞（B）与各自的对照细胞中E-cadherin、vimentin、N-cadherin、SNAIL1和PRMT5的蛋白表达。

C和D、免疫荧光检测circPRMT5沉默（C）和circPRMT5表达的UCB细胞（D）与其各自的对照细胞中E-cadherin、vimentin、N-cadherin的表达。细胞核用DAPI复染（左）。荧光强度用ImageJ分析。

4. circPRMT5可作为UCB细胞miR-30c的吸附海绵。

A、 Ago2 RIP法检测表达Flag-Ago2或Flag-GFP的UCB细胞中circPRM5的数量。

B、荧光素酶报告法检测与shRNA共转染的UCB细胞中LUC-circPRMT5的荧光素酶活性。

C、荧光素酶报告法检测转染83个miRNA模拟物库的UCB细胞中LUC-circPRMT5的荧光素酶活性，以确定能够与circPRMT5序列结合的miRNAs。

D、示意图显示了与circPRMT5相关的miRNAs的假定结合位点。

E、荧光素酶报告法测定与miRNA模拟物共转染的UCB细胞中LUC-circPRMT5或LUC-circPRMT5突变体的荧光素酶活性。

F、用circPRMT5或对照探针对UCB细胞中circPRMT5和miR-30c含量的RNA pull-down分析。

G、用circPRMT5探针对表达对照或circPRMT5 shRNA的UCB细胞中circPRMT5和miR-30c的RNA pull-down分析。

H、FISH实验验证circPRMT5和miR-30c的RNA共定位。

5. circPRMT5阻断miR-30c对UCB细胞的抑瘤作用。

A和C、通过划痕实验和侵袭实验检测，敲除circPRMT5抑制UCB细胞的细胞迁移（A）和侵袭（C）。miR-30c抑制剂可减轻circPRMT5基因敲除细胞的迁移和侵袭。

B和D、通过划痕实验和侵袭实验检测，circPRMT5的过度表达促进了UCB细胞的细胞迁移（B）和侵袭（D）。miR-30c模拟物可以帮助细胞迁移和侵袭。

E和F、肺的图像（左）、转移性结节（箭头所示），肺转移病灶的HE染色。与注射敲低circPRMT5细胞的小鼠相比，miR-30c抑制剂的过表达补偿了circPRMT5敲低对体内肺转移的抑制作用，而miR-30c的过表达可通过circPRMT5的过表达来增强体内肺转移（F）。

G和H、Western-blot检测显示circPRMT5敲除抑制了vimentin, N-cadherin和 SNAIL1/E-cadherin的表达，但是这种作用能被miR-30c抑制剂消除。而circPRMT5过度表达增强了上面三种蛋白的表达，这种作用能被miR-30c模拟物抑制。

H和J、免疫荧光检测的结果，用Image J软件进行分析。

6. circPRMT5调控了UCB患者miR-30c/SANIL1/E-cadherin通路。

A、circPRMT5的表达与UCB患者miR-30c表达呈负相关。

B、在UCB患者中，circPRMT5的表达与SNAIL1的表达呈正相关。

C、在UCB患者中，circPRMT5的表达与E-cadherin的表达呈负相关。

D、TCGA队列中miR-30c低表达与高表达的UCB患者 Kaplan-Meier生存曲线图。

E、散点图显示qRT-PCR分析的结果，在有淋巴结转移的UCB组织中miR30-c表达倍数与TCGA中无转移的组织对比。

F、在UCB患者中，miR-30c的表达与SNAIL1的表达呈负相关。

G、在UCB患者中，SNAIL1表达与E-cadherin呈负相关。

H、机制模式图，其中circPRMT5作为miR-30c海绵发挥作用，通过抑制UCB细胞EMT中miR-30c活性和侵袭调节SNAIL1/E-cadherin通路。

7.circPRMT5被分泌到UCB患者血清和尿液中的外显体中。

A、电镜下可见UCB患者血清（左）和尿（右）的外泌体（红色箭头所示）。B、Western-blot检测外泌体标记物CD63、TSG101、HSP70和ALIX的表达。

C、PCR检测血清外泌体中circPRMT5的丰度。UCB患者血清外泌体circPRMT5水平显著高于正常人（左）。有淋巴结转移的UCB患者血清外泌体circPRMT5水平显著高于无淋巴结转移的UCB患者（右）。

D、PCR检测尿外泌体中circPRMT5的丰度。UCB患者尿挖艾买提中circPRMT5水平显著高于正常人（左）。有淋巴结转移的UCB患者尿外泌体circPRMT5水平显著高于无淋巴结转移的UCB患者（右）。

E和F、UCB患者血清（E）和尿（F）外泌体中circPRMT5的表达水平与miR-30c呈负相关。

最后总结：

1. 本研究证明了circPRMT5是UCB组织中上调的一个重要的circRNA，circPRMT5的高表达与UCB患者的转移和/或较差的生存率呈正相关。

2.本研究发现circPRMT5的上调作为miR-30c的海绵，通过竞争miR-30c调节SNAIL1/E-cadherin通路促进UCB细胞的EMT；

3. 本研究发现过表达的circPRMT5是由外泌体分泌到UCB患者的血清和尿液中的，可预测肿瘤淋巴结转移。

鉴于SNAIL1/E-cadherin信号在肿瘤细胞EMT进展中的重要性，本研究结果首次表明circPRMT5可能成为人类UCB新的治疗靶点。

小分子RNA的研究思路一般包括：筛选鉴别、表达分析、功能分析和分子机制。这篇文献基本包括了上四个步骤的内容，主要研究的是circRNA的miRNA sponge功能，我做了一个总结图方便大家从这四个步骤去理解这篇文献，这样更容易掌握这篇文献的思路和脉络。

总的来说这篇文献是circRNA研究一篇很好的范文，不仅涉及表达谱分析，还涉及ceRNA机制，另外还从体内体外实验分别进行了分子机制的深入研究，最后的一部分还扯上了外泌体这个研究热点。虽然ceRNA机制已经不算什么新的东西，但如果大家想研究小分子RNA，可以跟其他热点结合起来做，所以这篇文献仍然可以作为一个很好的参考。

如果想作为课题申报，可以套用下面的选题模板：

XX circRNA通过XX miRNA调控XX分子/信号通路促进XX疾病/功能改变