体内和体外卵子成熟机制

（一）卵泡发育和卵子体内成熟机制

一个卵母细胞及其周围的体细胞构成卵泡，依据卵泡的发育时期及形态和功能特征，可分为几个阶段：始基卵泡－初级卵泡－次级卵泡－成熟卵泡。始基卵泡也称原始卵泡，是由卵细胞、前体颗粒细胞和基底膜组成，其卵细胞是卵原细胞，由生发上皮而来，卵泡细胞呈扁平单层排列。原始卵泡是储备的卵泡，由它进一步发育成其他卵泡。虽然很大一部分始基卵泡能够开始生长，只有非常小的一部分能够成熟，排卵， 具备受精能力。始基卵泡生长的最早变化是卵细胞中DNA和蛋白质合成的迅速增加及卵膜和卵浆的超微结构变化，这些代谢变化导致卵细胞明显增大。卵细胞充分生长，超微结构的完全分化和生理功能逐步完善，使其具备成熟分裂的生理活性。始基卵泡发育至直径lOOµm时称初级卵泡。初级卵泡的卵细胞是初级卵母细胞，颗粒细胞为单层立 友蛉或矮柱状。随着初级卵泡的发育，颗粒细胞通过有丝分裂方式不断增生，形成多层颗粒细胞围绕初级卵母细胞。

初级卵泡继续发育形成次级卵泡。颗粒细胞呈多层立方状或矮柱状围绕初级卵母细胞。初级卵母细胞直径增加到为原来的2倍时，在它的周围发育形成一层原膜，称为透明带(zona pellucida), 并出现卵泡生长发育所必需的三种特异性受体，即卵泡刺激素(follicular stimulating hormone, FSH)、雌激素(estrogen , E)、 睾酮(testosterone, T)三种受体＾次级卵泡的颗粒细胞开始分泌卵泡液，卵泡液在颗粒细胞间聚集形成卵 泡液腔，卵泡液内含有多种物质，如FSH、LH、前列腺素、多糖、蛋白质和高浓度的性激素。FSH诱发颗粒细胞芳香化酶的产生，并且诱发LH受体产生并逐渐增加。这时候的卵泡也称为有腔卵泡或窦卵泡。

窦卵泡的生长和成熟受促性腺激素的调节，即FSH和黄体生成素(luteinizing hormone, LH)。在生长中的窦卵泡，只有一小部分能够对上升的FSH产生反应，因此，大部分卵泡停滞于窦卵泡早期。在窦卵泡的早期，卵泡基底膜附近的梭形细胞形成两层卵泡膜，即卵泡内膜与卵泡外膜，两层卵泡膜与颗粒细胞之间由基底膜隔开。随着卵泡的生长发育，它由无血管的卵巢皮质移入富有血管的髓质。每个月经周期大约有20-个窦卵泡被选择，进入排卵前的发育过程。在窦卵泡发育的后期，颗粒细胞迅速增殖，分化为两个亚群，靠近基底膜的壁层颗粒细胞(mural granulosa cells) 和围绕在卵细胞周围的卵丘细胞(cumulus cells)。在体内， FSH和LH是卵泡发育必需的，而且，这两种激素都采用环磷酸腺背(cyclic adenosine phosphate , cAMP)通路作为细胞内第二信使。此外，许多生长因子和细胞因子也参与了这个过程。

排卵前卵泡是发育到最后阶段的卵泡，体积显著增大，直径可达20mm左右，卵泡液急骤增加，融合成 一个大的卵泡腔，卵泡移行向卵巢表面突出。排卵前卵泡中卵子直径达100~130µm,卵子表面环绕的一薄层颗粒细胞称放射冠，放射冠与卵母细胞之间为透明带。其结构从外向内依次为：卵泡外膜、卵泡内膜、颗粒细胞、卵泡腔、卵丘、放射冠、透明带、卵母细胞。

排卵前，卵子阻滞于第一次减数分裂前，在LH峰的作用下，卵母细胞才完成第一次减数分裂，核膜崩解，染色体从细胞分裂中期 I(metaphase I) 进展到细胞分裂末期 I(telophase I)。然后第一极体释放， 第一次减数分裂的完成，卵细胞进入细胞分裂中期II (methaphase II)。从形态学变化来看，卵细胞成熟包括：核膜崩解，也称为生殖泡破裂(germinal vesical breakdown, GVBD), 以及第一极体的释放。这些变化被称为卵子的核成熟。但卵子成熟还包括胞浆成熟，即卵胞浆发生的一系列变化，包括蛋白质合成、细胞器重排、微丝微管合成等，

胞浆成熟对卵母细胞的受精和早期胚胎发育至关重要。哺乳动物卵母细胞的大多数RNA在卵母细胞 的生长过程中积累并合成。GVBD发生1小时内RNA的合成持续维持低水平，一些新合成的RNA在GVBD前释放进细胞质。研究表明在排卵前，卵母细胞的代谢特征是活跃的转录和翻译。然而转录在排卵时休止，因而卵母细胞和早期胚胎的正常发育依赖于在排卵前积累的mRNA和蛋白质。在卵母细胞成熟过程中持续存在蛋白质翻译活性，积累的转录子和小分子支持减数分裂和受精后胚胎发育，直到胚胎基因组具有转 录活性开始调节胚胎发生发育。

卵胞浆成熟包括多个阶段特异性过程，如特异性蛋白的合成，皮质颗粒的释放，细胞内储藏的钙离子 的释放，线粒体的重定位和精子头部的解聚，这些过程对受精均有重要的作用。与核成熟相似，卵胞浆成 熟也是逐步获得的，它伴随着卵泡腔发育完成并需要体细胞和生殖细胞间缝隙连接的功能。另外生发泡中释放进细胞质的内容物可能在决定受精卵的命运上有作用，调节蛋白进入核和细胞质后可能会区域化地聚集，这种区域化可能在决定受精卵的极性和对随后胚胎发育有重要作用。

排卵前卵泡中存在大量的肖类激素，而卵母细胞内能检测到雌激素受体(ER)的存在。推测雌激素可能参与了卵母细胞胞浆成熟的一系列事件。雌激素通过与ER特异性结合发生作用。研究表明，在细胞质成熟过程中雌激素可能通过改变C汒释放系统作用于卵母细胞的表面，促进卵母细胞的膜成熟。未成 熟卵在体外培养时，细胞内C汒经历大幅度的波动，从而获得全能的Ca2+信号系统。这些卵母细胞将在受精过程中启动被激活的卵母细胞信号，使之打开胚胎发育的程序。激活的卵母细胞促使皮质颗粒胞吐，从而阻止多精受精并完成减数分裂开始胚胎第一次有丝分裂。因此卵母细胞应答雌激素以释放Ca2+的能力 是成熟过程中必需的步骤。

因为排卵前卵泡液中含有一定浓度的孕酮， 研究者推测胞浆成熟的信号转导可能需要特殊的卵泡内 孕酮环境。孕酮通过特异性地与细胞核孕酮受体结合产生作用。孕酮受体的A、B亚型结构相关但功能不 同，它们由同一个单基因编码，但转录为不同的mRNAs。孕酮受体的A、 B亚型表达受到雌激素和它的同源配体的调节。成熟的颗粒细胞参与细胞内Ca2+的代谢和刺激蛋白激酶的升高，它们协同降低孕酮的浓度。 卵泡液中孕酮与雌激素的比值可能是卵母细胞成熟的标记。孕酮可能也间接或直接地参与了卵母细胞膜c店释放系统的发育。

（二）卵子发育与成熟的超微结构改变

1. 卵母细胞核成熟的结构基础（减数分裂器的结构特点）真核细胞含有3种细胞质细丝：微管(microtubes) 、中间丝(intermediate filaments) 和微丝(microfilaments)。它们构成细胞骨架，为细胞提供结构支持并通过相关的分子运动蛋白的调节加强胞质运输和细胞活力。微管、微丝是构成减数分裂器的物质基础。减数分裂成熟的特征：核膜破碎，染色质浓缩，微丝重排，中间丝网重组并进入MII期。

微管为中空圆柱体，是减数分裂和有丝分裂纺锤体重要的结构成分，一旦微管系统被破坏，纺锤体即被解体，染色体聚集成团块状。体外培养的卵母细胞的减数分裂纺锤体比体内的明显长和宽，这可能是体外培养引起了微管蛋白浓度变化所致，同样这会对体外培养过程中极体的形成产生影响。

微丝，即肌动蛋白(actin),通过调节纤维肌动蛋白的功能及组配在卵子发生过程中保持生发泡的形态和位置。在减数分裂过程中，微丝与减数分裂器的运动相关联，微丝一方面为减数分裂器旋转提供动力，另一方面又对其旋转进行控制。 另外，微丝还参与了极体形成，在极体溢出处能观察到微丝的存在。

2. 核仁的超微结构 核仁是rRNA转录和随后合成核糖体亚基的场所。核仁的超微结构变化反映其转录活性，与减数分裂及发育能力所需蛋白质的合成与储存密切相关。核仁由纤丝成分组成，纤丝成分可再分为由原纤维成分包围的原纤维中心和颗粒成分。原纤维中心和颗粒成分很清晰地存在于活性的正在转录的核仁中，而失活的非转录核仁则由一个致密浓集的原纤维球组成，推测其可能代表核仁基质蛋白， 核仁致密化是减数分裂恢复的前提。原纤维中心是rRNA转录所需的酶（如RNA聚合酶1)的所在，另外rRNA-基因也定位于原纤维中心和致密原纤维成分中。分裂间期原纤维中心和致密原纤维成分之间发生 成RNA转录，随后致密原纤维成分被拼接并同蛋白质和其他非核仁转录本一起排列形成核糖体亚基从而组成颗粒成分。

卵母细胞核仁在初级卵泡和次级卵泡中被激活，其特征是原纤维中心内化，核仁呈颗粒状，这可能标志着rRNA-基因与核仁产生了联系，转录活性升高。而核仁功能在接近生长期末期时失活，其特征为原纤维中心边缘化(marginalization), 同样这可能是rRNA-基因从核仁缩回的信号。

3. 卵母细胞细胞质成熟的超微结构 卵母细胞胞质成熟在超微结构上表现为：细胞器结构重组，胞质内容物的改变等一系列复杂过程。研究表明卵母细胞生长与许多细胞质中细胞器的重定位和调整有关，也与一些特殊结构如透明带和皮质颗粒的发展进程有关。

在卵母细胞发育早期，大多数细胞器分布在生发泡周围。随着卵母细胞生长，高尔基体、线粒体、内质网、皮质颗粒等细胞器数量不断增加，且向皮质区迁移，在细胞中央形成不含细胞器的 ＂透明区＂。线粒体在细胞代谢中起主导作用，其形态、数扯及分布的变化与细胞的代谢水平、增殖及分化密切相关。卵母细胞成熟时线粒体由皮质又转而向胞质中央区扩散，这有利于卵母细胞充分成熟过程中能量的利用。皮质颗粒是卵母细胞所特有的细胞器，卵母细胞成熟时其在质膜下呈线状排列，这对于保证单精受精及胚胎正常发育具有重要意义。 因而皮质颗粒增殖及沿质膜呈线状分布被认为是卵母细胞成熟的标志之一。与鸟类的卵黄相似，哺乳动物卵母细胞中脂质小滴代表能量库，卵母细胞在整个获能和最终成熟期脂质数量逐渐增多，这对胚胎发育具有启动作用。不同哺乳动物卵母细胞成熟过程中，各种细胞器的变化规律不同，这些超微结构在种间的差异对胞质成熟产生的具体影响目前仍未知。但这种差异似乎是造成不同动物卵 母细胞在体外培养条件下获得成熟率有差异的原因。此外卵母细胞质膜表面的微绒毛由粗短变为细长，由倒伏于卵质膜表面而后竖起是质膜充分成熟的标志，极体释放部位微绒毛密度降低。