单克隆抗体作用机制-Fab和Fc相关

单克隆抗体药物日益广泛地应用于肿瘤、自身免疫疾病和感染性疾病等的诊断、预防和治疗,更多的单克隆抗体药物目前处于临床试验的各个不同阶段。了解抗体药物的作用机制,有助于制订适用于患者的治疗方案以及研发新一代抗体药物。 目前处于研发不同阶段和已经进人临床使用的单克隆抗体药物的种类很多，包括完整单克隆抗体及其片段、完整单克隆抗体及其片段的偶联（融合) 物。本章主要讨论目前应用最广泛的完整单克隆抗体，也就是免疫球蛋白（IgG)，尤其是人IgG,的作用机制。任何化合物分子的功能都是由其结构决定的，单克隆抗体也不例外。单抗由抗原结合部位（Fab)和可结晶部位（Fc)构成一个“Y”形结构。 Fab识别结合抗原靶标，由此决定单抗的特异性和亲和力;Fc可以结合表达于免疫效应细胞表面的Fc.受体 ，以及血液中的补体和清道夫受体（FcRn), 由此决定单抗的免疫效应以及在机体内的半衰期。根据单抗的这一结构特点，我们可以粗略地将其作用机制划分为Fab相 关 和Fc相关作用机制。

第 一 节 F ab相关作用机制

由于单抗识别的抗原具有不同的生理学功能，所以对应的抗体也有不同的作用功能，包括对游离蛋白靶点分子的中和及对细胞表面受体的桔抗或者激活。

一 、识别游离分子祀点的单抗

游离存在于血液循环中的细胞因子、生长因子、生物毒素以及人侵的病毒等，都可以作为单抗的作用靶点。蛋白因子通过与受体的结合，传导信号进人细胞，调控细胞的功能。过量表达的蛋白因子传导过量的信号，打破细胞的正常功能平衡。毒素和病毒等也必须通过与细胞表面的受体结合进人细胞内部，才能发挥作用。中和抗体的作用机制就是通过结合抗原进行中和,使抗原丧失结合受体的能力，进而丧失生物学功能。下面以几个代表性的抗

体为例，对这种作用机制进行说明。

( - ) 血管内皮生长因子（VEGF)抗体

恶性肿瘤的生长需要新生血管输送营养、氧 气 、生长因子和激素等来支持，阻断或破坏肿瘤新生血管可以切断肿瘤的营养供给,导致肿瘤细胞死亡。在目前已经确定的血管生长因子中,VEGF是最重要的特异性调控正常血管生长和病理性血管生长的生长因子。VEGF具有很多生物学功能，包括诱导内皮细胞分裂和迁移、诱导蛋白水解酶降解细胞外基质、提髙血管渗透性以及维持新生血管的存在。 VEGF的这些生物学功能是通过结合与刺激内皮细胞表面的VEGF受体(VEGFR-l、-2和-3)来实现的。在目前诊断的大多数人类肿瘤中都发现了 VEGF的过量表达，并且证实了 VEGF的高表达与癌症患者的预后不良具有相关性。用单抗抑制VEGF的活性，可以有效抑制许多人类肿瘤细胞株在裸鼠体内的生长，尤其是在与化疗药物联合用药的情况下。

bevacizumab是一个重组抗VEGF的人源化单抗，商 品 名 为avastin。 bevacizumab与细胞毒化疗药物联合使用,对许多种类的癌症都取得了显著的疗效,包括结直肠癌、肺 癌 、乳腺癌 、卵巢癌和肾癌等。基于这些结果，bevacizumab被 美 国FDA在 2004年批准与氟尿嘧啶合用于对晚期结直肠癌的治疗。现在巳经被批准用于非小细胞肺癌、成胶质细胞瘤、转移性肾细胞癌等肿瘤类型的治疗。对转移性HER2/neu阴性乳腺癌的治疗还存在争议。虽 然 FDA在 2008年批准其与紫杉醇联用治疗乳腺癌，但是 又 在 2010年因为其安全性和有效性不足而撤销了批准。 bevacizumab对于其他类型肿瘤的治疗目前处于评价过程的不同阶段。

(二 ）肿瘤坏死因子（TNF)抗体

TNF是一种主要由巨噬细胞在细菌脂多糖( LPS),细菌其他产物和白介素-1 ( IL-1) 等刺激下产生的细胞因子。 TNF的首要功能是调节免疫细胞,也具有诱导细胞凋亡/ 死 亡 、诱发炎症反应和抑制肿瘤形成、病毒复制的功能。由于TNF可以诱发炎症反应,在某些情况下会导致自身免疫紊乱，比如类风湿关节炎、强直性脊柱炎、炎症性肠道疾病、银屑病、化脓性汗腺炎及顽固性哮喘等。这些疾病都可以使用TNF抑制剂来进行治疗。

infliximab和 adalimumab都能结合TNF-a,从而抑制TNF受体的激活。 infliximab被美国 FDA批准用于治疗银屑病、克罗恩病、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、类风湿关节炎和溃疡性结肠炎。 adalimumab则用于治疗类风湿关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩

病 、慢性中度至重度牛皮癣和幼年特发性关节炎。

( 三）炭疽毒素中和抗体

2001年“9 • 11”恐怖袭击之后，如何应对生物恐怖袭击，尤其是炭疽杆菌的袭击，已经引起了许多国家的重视。炭疽杆菌的芽孢具有顽强的生命力，通过皮肤创口、胃肠黏膜或者呼吸途径进人人体后，首先在局部繁殖，产生毒素,导致组织及脏器发生出血性浸润、坏死和高度水肿。炭疽毒素由保护性抗原（PA )、致死因子（LF)和水肿因子（EF)组 成 ，其中保护性抗原通过结合细胞表面受体，帮助致死因子和水肿因子进人细胞内部。炭疽毒素能够抑制正常免疫系统功能,干扰信号传导通路，从而导致细胞死亡。

raxibacumab是美国研发的一种抗炭疽毒素保护性抗原的人源抗体, 属 于 带 X 轻链的IgG,。这种抗体通过识别结合PA，阻 止 LF和 EF进入细胞，使炭疽毒素失去毒性作用。 目前已经完成了许多动物模型的炭疽菌接触前预防和接触后治疗试验,以及人体的安全性评价。在大鼠、家兔、食蟹猴身上的动物实验表明，raxibacumab可以有效预防炭疽病灶的出现和提高实验动物的存活率m 。

二 、识别细胞表面受体的单抗

每一种抗体都可以特异性结合特定的抗原靶点。靶点抗原表达在特定细胞表面，具有特定功能，例如细胞激活、生长或迁移。根据抗体Fab活性，抗体与其靶受体的相互作用，可以分为结合、拮抗和激活。结合型抗体只是结合在靶蛋白上面，并不干扰其功能。因此，靶蛋白受体的配体仍然可以与其结合，从而传递信号。结合型抗体可以用于标记靶细胞，从而让 其 Fc产生的效应功能或其搭载的效应分子（如放射性核素、细胞毒药物、生物毒素等）杀灭靶细胞。拮抗型抗体封阻受体上的与配体相互作用的抗原决定簇，阻止配体结合产生的信号传导。激活型抗体模拟配体的功能,识别结合靶受体并传导信号至细胞内部。基于被激活的细胞内信号强弱,激活型抗体可能在治疗时会激活靶细胞，产生细胞因子，从而产生副作用。

大部分被抗体识别结合的靶点都是肿瘤相关抗原,都是许多恶性肿瘤过量表达的生长因子受体。这些受体在正常生理状态下的激活引发细胞分裂，维持细胞生长。在过量表达或持续激活的状态下会促进细胞的过度生长以及肿瘤细胞对化疗药物的抗性。无论哪一种抗体,都是通过结合受体、影响其功能、干扰信号传导，从而抑制细胞生长、诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期等。

( - ) 抗表皮生长因子受体（EGFR)抗体

EGFR是一种跨膜受体酪氨酸激酶，是表皮生长因子受体家族的4 个成员之一，由胞外配体结合区,跨膜区及胞内酪氨酸激酶区三部分组成。其氨基端的胞外区能够结合表皮生长因子，转化生长因子-a，双调节素等配体。 EGFR在非活性状态下是单体，当与配体结合后可形成同源或异源二聚体，激活受体胞内区发生自我磷酸化，并启动一系列胞内信号级联。与之相关的信号通路和信号传递蛋白包括磷酯酶 C-71(PLC-71 )、磷 酯酰肌醇 3 激酶(PI3K)、丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶等。最终激活相关核蛋白，促 进 细 胞 从G1,期过渡到S 期 。EGFR在正常和恶性表皮细胞表面都有表达,具有促进细胞增殖、转移、血管生成以及抑制细胞凋亡的功能。肿瘤细胞最常见的EGFR异 常 是 EGFR受体过量表达, 导致不依赖于配体的二聚化，从而持续传递激活信号。 EGFR在实体瘤中过量表达往往标志着病情的进一步发展和不良预后。

目前巳经有几种抗EGFR的单克隆抗体应用于临床,更多的抗体还处于临床试验及临床前研究的不同阶段。下面以cetuximab和 panitumumab这两种目前应用比较广泛的抗体为例来进行说明。

cetuximab是由美国研发的一种人/ 鼠嵌合IgG,抗 体 ，识别 结 合 EGFR的胞外区,用于晚期头颈部鳞癌和转移性结直肠癌的治疗，近来研究显示对非小细胞肺癌也有治疗效果。其结 合 EGFR的 亲 和 力 为 0_1 ~0.2nmol/L,高 于 EGFR的 内 源 配 基 ，例 如 EGF、 TGF-a 。cetuximab结 合 EGFR后 ，抑制受体酪氨酸激酶活性以及相关下游信号通路。许多研究证实cetuximab可以导致很多肿瘤细胞株的细胞周期阻滞,有些还进一步导致细胞凋亡，抑制血管生成和细胞侵袭。人结肠腺癌细胞DiF^、口腔鳞状细胞癌细胞、人前列腺癌细胞DU145等经 cetuximab处理后，细胞大部分被阻滞在&,期 ，同时细胞周期素依赖性激酶2( CDK2) 和细胞周期素cyclin A ，E 相关组蛋白H1激酶活性都降低。然而，细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白 27(P27KIP1)的表达却得到提高W 。许多试验证实,cetuximab可以降低肿瘤细胞产生的血管生成生长因子,如 VEGF、BFGF和 IL-8，从而显著降低异体移植的人肿瘤中的微血管密度和提高血管内皮细胞的凋亡。恶性肿瘤细胞的侵袭和转移依赖于胞外蛋白酶的分泌，尤其是基质金属蛋白酶（MMPs)家族。 cetuximab抑 制 很 多 种MMPs,包括胶原酶（MMP-9) 的表达和酶活性。这种抗体介导的MMP表达的下降与体外肿瘤细胞侵袭的显著降低和裸鼠体内肿瘤生长转移的抑制呈正相关。

panitumumab是全人源 IgG2抗体 ，识别结合EGFR的胞外区,亲和力 极高，达到 5 Xl(T"mol/L。美 国 FDA在 2006年批准其用于转移性结直肠癌的治疗。 panitumumab是用EGFR高表达细胞A431免疫人抗体转基因小鼠XenoMouse，经传统杂交瘤技术获得的。由于是全人源的序列，所 以 panitumumab在人体的耐受性特别好,患者不需要预先给药处理，同时产生人抗鼠抗体反应（HAMA)的可能性很低。在体外,panitumumab有效抑制人宫颈表皮癌细胞A431、乳腺癌细胞MDA-468的繁殖，同时也阻断自分泌生长刺激，抑 制 EGF/TGFa 介导的肿瘤激活和增殖。 panitumumab抑制前列腺癌细胞DU145产 生 VEGF和白介素-8,间接抑制肿瘤的血管生成。在异种移植人不同实体肿瘤的小鼠模型中，包括乳腺癌（MDA-468)、胰腺癌（BxPC-3 和 HS766T)、前列腺癌（PC-3)、肾癌（SK-RC-29)、卵巢癌（IGROVI) 和结肠癌（HT-29) .panitumumab都显示出活性，阻 断 EGFR的信号传导，抑制肿瘤的生长。值得注意的是，不 仅 EGFR高表达的肿瘤生长受抑制，一 些 EGFR低表达的肿瘤生长同样受到抑制。 panitumumab的抗肿瘤活性非常强，即使不与化疗药物联用，也能引起已经成型的A431肿瘤完全消退。当然，与化疗药物联用时显示出更强的疗效。

(二 ）抗人表皮生长因子受体2(HER2)抗体

HER2是表皮生长因子受体家族的另一个成员。与 其 他3 个成员不同，HER2没有自己的配基，可以不依赖于配基形成HER2/HER2同源二聚体，或 者 HER2/HER1、HER2/HER3异源二聚体,激活下游的信号通路，包 括 PLC-71、Ras-Raf-MEK-MAPK、PI3K-AKT、Src、PAKJNNK-JNK和 STATs，进而调控细胞增殖、分 化 、迁 移 、黏 附 、凋亡和转化。 HER2在 20% ~30%的乳腺癌患者中有过量表达,其他癌症也有报道。 目前，有几种技术方法测量HER2的表达水平,包括免疫组织化学法（IH C)、酶联免疫吸附法（ELISA)和荧光原位杂交（FISH) 。其中有两种IHC和两种FISH的检测试剂盒已经得到FDA的批准，用 于 HER2表达水平的检测。 HER2的高表达与癌症发生，癌症预后不良都有很强的关联性

Trastuzumab是人源化的抗HER2 IgG,抗 体 ，识别结合HER2的胞外区，阻 止 HER2 二聚体的形成，从而阻断HER2传递信号。 tmstuzmnab对细胞生长和存活的影响还不完全清楚，可以抑制某些HER2高表达的肿瘤细胞繁殖和存活，对某些则没有作用。但 是，trastuzumab能够抑制HER2的激活以及下游信号分子，如 MAPK和 PI3K-AKT的磷酸化,降低存活素( survivin)的水平和细胞调亡的抗性。另夕卜,trastuzumab部 分 通 过 PI3K-AKT信号通路影响与细胞周期进程和细胞生长/ 维持相关的基因。临床前研究表明,trastuzumab诱 导 p27KIPl，显著提高其半衰期，从而阻滞细胞在G,期 。 trastuzumab也显示了抑制肿瘤诱导的血管生成

作用。在小鼠的异体移植肿瘤模型中，tmstimmmb导致肿瘤血管的正常化以及萎缩，显著降低肿瘤血管的直径和数量及血管的通透性。血管新生因子的基因表达分析显示，trastuzumab降低了 VEGF、转化生长因子-ct、纤溶酶原激活物抑制剂-l(PAI-l)、血管生成素-1等促进血管生成的因子的表达，提髙了抗血管生成因子血小板反应蛋白1(TSP1)的表达。过量表达的 HER2容 易 在 金 属 蛋 白 酶 的 作 用 下 水 解 成 游 离 的 胞 外 区 和 截 短 的 膜 结 合 片 段 。trastuzumab结 合 在HER2的胞外区，有 效 防 止HER2的蛋白水解。临床研究表明，经 trastuzumab治疗的患者血液中游离HER2胞外区数量下降,预示了肿瘤对抗体的反应和提高的无进展生存期。

(三 ） CD20抗体

CD20是一种非糖基化的磷酸化跨膜蛋白，因丝氨酸和苏氨酸上的不同磷酸化而呈现3种异构体,分子量分别是33、35、37kDa。 CD20的表达局限于B 前体细胞和成熟B 细胞。当B 细胞分化成为浆细胞后，CD20表达消失。但 是 在 转 化B 细胞，如非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病中都有表达。因为CD20不在造血干细胞B 细胞中表达，B 细胞生成和其他细胞谱系不会受到CD20的影响。而且，CD20也不在浆细胞中表达，因此抗CD20抗体治疗不会降低抗病原体免疫球蛋白的产生。所 以 ，CD20是用抗体进行靶向治疗的很好的靶点。目前还没有发现CD20的天然配体，其功能也不完全清楚。 CD20基因敲除小鼠的B 细胞发育 、组织定位、信号传导、增殖、T 细胞依赖抗体反应以及亲和力成熟都很正常。只是不成熟和成熟B 细 胞 IgM的表比野生型小鼠低20%〜30%，CD19介人引起的胞内钙反应显著降低。因此,现在一般认为CD20参与了 BCR活化的钙离子流入。

rituximab是一种人/ 鼠嵌合抗体IgGlK，识别结合CD20胞外区的两个多肽片段形成的抗原决定簇，（170) ANPS( 173)和（182) YCYSI( 185) 。一般认为 rituximab 结合 CD20 会形成一个信号平台（脂筏，lipid rafts)，激 活 Src酪氨酸激酶家族，然后引起钙流和caspase的激活，最终 导 致B 细胞凋亡。另 一 方 面 ，rituximab与 CD20的 结 合 吸 引 Fas相关死亡结构域蛋白( FADD)和 caspase-8等组成死亡诱导复合体（DISC) 。 rituximab通 过 下 调 MAPK、NF-kB和Akt，抑制抗凋亡基因的表达，如 Bcl-2/Bcl-xL、X-连锁凋亡抑制蛋白、髓性细胞白血病序列1，从而致敏非霍奇金B 细胞淋巴瘤发生细胞凋亡。 NF-KB 信号通路的抑制阻断下游转录抑制子 阴 阳1( YY1)，增 强 Fas和死亡受体5 介导的细胞凋亡转录。也有研究认为相关的凋亡通

路是不依赖于caspase或 Fas配体/Fas死亡通路，不依赖于线粒体，不需要脂筏的形成。由二抗或者带Fc受体的免疫细胞引起的rituximab交联通常提高其诱导的细胞凋亡。除了诱导细胞调亡,rituximab与 CD20的结合还可以直接导致淋巴细胞的生长停滞。 rituximab在体外中等强度诱导肿瘤细胞富集在&,期 ，显著抑制克隆形成能力，但是并不诱导细胞凋亡。这个直接的生长抑制可能通过神经酰胺触发信号通路介导，导致细胞周期依赖性激酶抑制剂 ，如 P27KiPl 的产生U5]。

第 二 节 F c相关作用机

单克隆抗体的Fc部位决定抗体的效应功能,包括抗体依赖细胞毒作用（ADCC) 和补体依赖细胞毒作用（CDC)。 ADCC由 Fc与 FC7REIa相互作用触发，而 CDC则 是 Fc与一系列血液中的补体系统组分相互作用触发。抗 体 的 Fc还与新生儿Fc受体（FcRn)相互作用,决定着抗体的半衰期/ 清除速率。

一 、抗体依赖细胞毒作用（ADCC)

当抗体通过抗原结合部位结合肿瘤细胞表面抗原以及Fc部位结合免疫效应细胞表面Fc受体时，免疫效应细胞得到激活，杀死肿瘤靶细胞,这 个 过 程 称 为ADCC。人 的 IgG抗体分 为 IgG,、1 # 2、1803和化04四个亚型，与 Fc受体的亲和力不一，通 常 IgG,最高。 Fc受体主要 有 3 种 ,Fc7R I ( CD64)、FcryR II ( CD32)和 Fc7RIII ( CD16) 。其中后面两种低亲和力的受体可以进一步细分为Fc7R n a(激活性受体）、Fc7R n b (抑制性受体）和 Fc7R H c(激活性受体 ），以 及Fc7Rm a(激活性受体）和 Fc7R mb( 没有胞内区,通过糖基磷脂酰肌醇锚定在细胞表面）。不同的免疫细胞种群表达特定的Fc受体，例如中性粒细胞通常表达Fc7R I、Fc7Rn和 Fc7Rnib，而 NK细胞只表达低亲和力的Fc7RIIIa。 Fc7R]IIa通常认为是引起ADCC的关键受体，所以虽然NK细胞，单核巨噬细胞和中性粒细胞都可以产生ADCC作 用 ，但 是 NK细胞认为是其中最重要的细胞种群。激 活 的NK细胞分泌穿孔素和颗粒酶等细胞毒颗粒直接杀死肿瘤靶细胞，同时也分泌IFN-7等细胞因子和化学因子来调控其他免疫细胞。

虽然许多抗肿瘤抗体在体外都显示ADCC作 用 ，但 是 ADCC这一作用机制与临床有效性之间的关联还没有得到完全证实。 Clynes等人通过比较几种临床有效的抗体对接种于野生型小鼠和Fc7R n /m 基因敲除小鼠体内的人异体移植肿瘤的疗效，对 Fc受体相互作用的重要性进行了评价。这些抗体在Fc7R 基因敲除小鼠体内的疗效远不如野生型小鼠，但是在只敲除了抑制性Fc7R 的小鼠体内疗效得以保持甚至增强。这些结果表明,抗 体 与 Fc受体

相互作用是抗体在小鼠体内抗肿瘤有效性的基础，并且对某些抗体在临床上的有效性也具有重要作用。在 对 rituximab的临床研究中发现,某些淋巴瘤患者的治疗效果远远好于其他患者。后经分析发现,这些“高应答个体”患者都具有相同的Fc受体多态性。人 的 CD16蛋白 由 于 在 158位氨 基 酸是缬氨酸（V )或 苯 丙 氨 酸 （F )而呈现两种多态性，CD16-158V和CD16-158F。 CD16-158V与 抗 体 Fc部 位 的 亲 和 力 高 于CD16-158F。带 有 CD16-158V/V纯合体的患者比带有CD16-158F/F纯合体以及V /F杂合体的患者对rituximab更敏感,其肿瘤治疗的预后也更好。这些研究表明抗体Fc部 位 和Fc受体的相互作用至少在一定程度上是rituximab临床疗效的基础，同时也显示了 ADCC的重要性。单克隆抗体介导的ADCC强弱跟许多因素有关，比如抗体与抗原的亲和力，抗 体 与 Fc

受体的亲和力、肿瘤抗原的密度、肿瘤靶细胞的特性以及免疫效应细胞的特性等。 一 般情况下 ，肿瘤靶细胞与免疫效应细胞通过抗体的桥联结合越紧密,ADCC作用越强。因此,对抗原 或 Fc受体亲和力高的抗体介导的ADCC作用更强。表达靶抗原高的肿瘤细胞对ADCC更为敏感，容 易被ADCC作用所杀死。但是我们在实践中也发现一些高表达抗原的肿瘤细胞 对 ADCC表现出抗性，这可能与肿瘤细胞的本身特性有关，比如下调与免疫突触形成有关的黏附分子，上 调 与 细 胞 修 复 有 关 的 蛋 白 等 。同 时 ，免 疫 效 应 细 胞 本 身 的 特 性 也 影 响ADCC,比如NK细胞表达的Fc受体的多态性，对免疫调节因子的反应性等。改造抗体,提

髙其对抗原或Fc受体的亲和力，可以提高抗体介导的ADCC作 用 ，这是提高抗体抗肿瘤活性的直接、快速和有效的一个途径。提高抗体对抗原的亲和力可以通过体外亲和力成熟来实现，这一过程主要是在体外模拟体内抗体的亲和力成熟过程。具体的方法手段有很多,包括噬菌体、核糖体、酵母表面呈现 ，以及倾错PCR和链替换等。

提髙抗体对Fc受体的亲和力可以通过改造抗体Fc部位的糖基化和氨基酸序列来实现。位 于 IgG抗 体 CH2结 构域297位的天冬酰胺是一个保守性的氨基酸，其糖基化对于抗体 与 Fc受体的相互作用很关键。IgG N297上 N-连接的低聚糖通常是一个复合型结构，由甘露糖化-壳二糖核心（Man3GlcNAc2-Asn) 外加不等的平分型乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc) 、核心岩藻糖、非还原性末端Gal和唾液酸组成。对一系列截短糖基IgG的研究显示,Fc部位低

聚糖的ct( 1-6)结构的糖残基与CH2结构域内表面的非共价相互作用决定了蛋白-低聚糖复合物的整体构象。如果逐渐截短低聚糖组成，一个类似于马蹄型的结构就会显露出来。当低聚糖截短到三糖时，其结构完整性和功能性都下降。当进一步截短到只剩最初的N-乙酰葡萄糖胺残基时，其功能性完全丧失。核 心 P-甘露糖残基上的平分型GlcNAc对抗体的生物学活性，尤 其 是 ADCC的影响比较大。从 N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶nUGnTffi) 转染的CHO细胞中产生的抗体含有大量的平分型GlcNAc。这种抗体较普通抗体的ADCC活性强

10倍 。过多的唾液酸残基降低抗体与Fcr/REIa及抗原表面的结合，从 而 影 响 ADCC活性。在所有的糖组分中，岩藻糖被认为是影响ADCC活性的最重要的糖。去掉岩藻糖可以显著提高抗体与F q R IIIa的亲和力及ADCC活性。研究显示，不论抗体识别的抗原是什么,抗体的种属来源和亚型是什么，其 Fc部位的去岩藻糖化都可以提高ADCC活 性 高 至 100多倍，同时也提高了体内抗肿瘤活性。由于目前几乎所有商业化的治疗用抗体都是利用哺乳动物细胞大规模发酵产生，而 且 ex-1，6-岩藻糖基转移酶（FUT8) 是催化低聚糖岩藻糖化的关键酶。所以，抑制或者完全消除生产细胞株的FUT8活 性 ，就可以很容易得到去岩藻糖化的抗体。 目前巳经有研究小组获得了 FUT8基因敲除 的CHO细胞株。这一改造后的CHO细胞除了没有FUT8基因表达外，其他如细胞形态、生长动力学、蛋白产量等与野生型CHO并无不同。用 这 种 FUT8缺 陷 的 CHO细 胞 产 生的体不含岩藻糖残基 ，具 有 很 强 的 ADCC活性。

目前，对于突变Fc部位的氨基酸序列以获得可以介导高强度ADCC的抗体研究得比较充分。通过引入不同的点突变改造人IgG, Fc部位的氨基酸,再测定这些突变抗体的亲和力及介导ADCC的能力,研究人员初步绘制出了人IgG,抗体与不同的激活性Fc受体和抑制性受 体 FcRHb的结合图谱。当 Pro238、ASp265、ASp270、ASn297(丧失糖基化）和 Pro329氨基酸残基被突变成为丙氨酸时，Ig G Jf于 所 有 FcR的亲和力都下降。所有这些氨基酸残基都位 于 IgG CH2结构域靠近CHI、CH2铰链区。这一区域连同其前端的铰链区共同构成IgG,

与 Fc7R 的结合部位。对 于 Fc7R ina而 言 ，拥 有 3 个突变（S298A、E333A、K334A) 的抗体显示最强的结合能力和介导ADCC的能力。另外一个研究小组应用酵母呈现系统筛选了大量的 Fc突 变体，发 现 一 个 拥 有 5 个 突 变 （F243L、 R292P、Y300L、 V305I、 P396L) 的突变体对Fc7R m a的亲和力提高了 10倍 ，同时也具有更强的ADCC活性。基 于 Fc-FqR结合面的结构信息,运用计算设计和高通量筛选评估技术发现, IgG, Fc突变体（32390、43301^、1332£)对 FC7RIEa 的亲和力提高了 100倍 ，但是对抑制性受体FcR H b 的亲和力提高有限。因此，这一突变抗体在体外和食蟹猴体内都介导很强的ADCC活性[IM9]。通过对抗体的改造获得具有更强ADCC活性的强化抗体,具有显著的临床应用价值。一方面,一些原本对野生型抗体不敏感的抗原低表达肿瘤对强化抗体治疗敏感。另一方面，带 有 Fcr/RIHa 158F多态性的“低应答患者”在使用强化抗体时可能产生有效应答。同时，强化抗体的使用剂量也可以缩减，同样可以达到髙剂量野生型抗体的疗效。这可以大幅减低抗体的使用剂量，降低医疗成本。然 而 ，强化抗体也会产生副作用，比如一些低表达抗原的正常组织细胞也会受到强化抗体的作用，但不会受到野生型抗体的作用。不论是点突变改变氨基酸，还是改变糖基结构,都是人工改变了野生型抗体的结构，增大了应用于人体时导致抗抗体产生的可能性。

二 、补体依赖细胞毒作用（CDC)

补体是存在于人或脊椎动物血清与组织液中的一组不耐热的，经活化后具有酶活性的蛋白质，包 括 30余种可溶性蛋白和膜结合蛋白。补体系统的主要功能是通过在病原体等靶标表面的作用，破坏其细胞膜或者调理病原表面供巨噬细胞吞食，此外还能引起炎症反应。不同亚类的抗体具有不同的激发CDC的能力。虽 然 IgM是激活补体能力最强的抗体亚类，但是因为分子量大，不容易穿透血管壁,并不广泛应用于临床肿瘤治疗。 IgG,和 IgG3

都能有效通过经典途径激活补体。在这个激活级联过程中，抗原-抗体复合物的形成导致IgG蛋 白 CH2结构近端的多个C lq 结合位点暴露。这种蛋白构象的改变使原本低亲和力的 Clq-IgG亲和力大大提高，从而触发一系列级联反应。最终的结果就是在靶细胞膜上形成膜攻击复合物，产生直径约100A的穿孔，导致细胞内容物的外泄。

抗 CD20抗 体 rituximab的一个重要作用机制就是CDC。研究显示,rituximab可以完全治愈接种有稳定转染人CD20的小鼠淋巴瘤EL4细胞的免疫完全小鼠。然 而 ，其治疗作用在 C lq 基因敲除小鼠体内完全丧失。在临床上，慢性淋巴细胞白血病患者在接受rituximab灌输治疗后，其 体 内 的 补 体 系 统 组 分 快 速 消 耗 丧 失 。一 般 认 为 ，CDC对 于 riruximab和alemtuzumab的疗效有效性起重要作用，但是否也与其他抗体的抗肿瘤活性有关还不清楚。

有研究认为，在是否导致CDC的作用上，肿瘤抗原靶点（比如在细胞整个表面，甚至细胞表面某一区域的密度）比抗体本身更重要。高密度抗原靶点富集高密度的抗体,从 而 为C lq 的激活创造了条件。从 NHL患者体内分离的B 细胞，只有在CD20的表达水平达到50xl03蛋白分子/ 细胞时才会被rituximab通 过 CDC作用机制裂解杀死。同时，CD20阳性细胞对rituximab介 导 的CDC的敏感性与其CD20的表达水平正相关。虽 然 CDC并不被认为是抗肿瘤抗体的主要作用机制,CDC产生的许多因子可能强化ADCC作用。例如产生的化学趋化/激活因子C3a和 C5a形成一个浓度梯度,从而吸引NK细胞等免疫效应细胞到达肿瘤部位。CDC的副产物，过敏毒素C5a是激活许多天然免疫效应细胞的关键因子，可以上调激活性Fc-y受体的表达,下调抑制性受体Fc7R H b 的表达, 从 而 强 化 肿 瘤 部 位 的ADCC作用。

但是也有研究认为,抗体引起的补体激活对抗体的治疗效果起负面影响作用。 rituximab引起的补体激活产生大量C3,沉积在结合靶抗原的抗体上，妨碍了其与NK细 胞 上Fc7R 的结合,从而抑制NK细胞的活性，降 低 ADCC的作用。这一现象在体外和小鼠体内实验中都得到证实。当然，CDC究竟在抗体抗肿瘤活性中起什么作用，起多大作用，还需要更深一步的研究。

补体介导的这个肿瘤细胞裂解作用受一系列补体调控蛋白的抑制，包 括 CD35( I 型补体受体）、CD46(膜辅蛋白）、CD55(促 衰 变 因 子 ）和 CD59(膜反应 性 溶 破 抑 制 物 ，保护素 ）。这 些 补 体 调 控 蛋 白 抑 制 细 胞 表 面 补 体 的 蛋 白 水 解 酶 级 联 ，显 著 降 低 rituximab的CDC活性。 rituximab治疗后复发肿瘤细胞高表达CD59以及非霍奇金淋巴瘤患者大淋巴结肿瘤高表达CD55，显示补体调控蛋白的表达可能是肿瘤对抗体治疗产生抗性的一个原因。一种临床用于慢性淋巴细胞白血病和惰性非霍奇金淋巴瘤的抗肿瘤药氟达拉滨可以有效下调CD55和 CD59的表达,与 rituximab合用可能会有较好的增效作用。由 于C lq 与

抗体的结合是触发补体级联反应的第一步，改 造 抗 体, 提 高 与 C lq 的亲和力就可能提高CDC。对 人 IgG,的 C lq 结合位点详细图谱的绘制，导 致 了 对 C lq 高 亲 和 力 的rituximab突变体的研制成功。通过基因突变改造CH2结构域和铰链区的特定氨基酸或者替换IgG, ，IgG3重链恒定区序列构建IgG /IgG Jg合 抗体，都可以提高对C lq 的亲和力以及高CDC活性。IgG, N297上 的 N-连接糖基对CDC也有重要作用，去糖基化抗体的CDC作用明显下降.