小鼠BMMSC原代细胞提取（个人总结，仅供参考）

一、准备工作：

1.      前一天消毒手术器械、PBS、1000ul 及200ul蓝&黄木仓头，在细胞间内配好含5%双抗的PBS、

2.      准备物品：6W昆明雄鼠、眼科剪*2、眼科镊＞7把、持针器*1、75%酒精、1000ul及200ul移液枪、擦手纸、PBS、双抗、10cm细菌培养皿*4、10ml注射器、1ml注射器、胎牛血清、αMEM培养基、T25、15ml及50mlEP管、冰盒（打冰）

3.      细胞台紫外线照射30min（内放置含有剪刀*1、镊子*6、持针器*1的手术器械盒、移液枪、细菌皿*4、T25、黄蓝木仓头、10ml&1ml注射器、PBS、15ml&50ml EP管）

4.      层流室（细胞间）内准备α-MEM、双抗、胎牛血清

5.      动物手术台准备动物尿垫、装有75%酒精的容器、眼科剪、眼科镊、擦手纸*1、冰盒（内置冰+含5%双抗的PBS—用于存放取出来的胫骨、股骨）

二、具体步骤：

1.     小鼠脱臼处死后，75%乙醇浸泡5min

2.     动物手术台小鼠两小腿去皮，剪断膝关节及踝关节周围的白色肌腱，分离胫骨及股骨，钝性分离骨头周围的肌肉，可用擦手纸搓去表面的肌肉残余（注意不要暴露骨髓腔），浸泡至含5%双抗的PBS内（放于冰盒内），放置于传递窗内；

3.    细胞间内在含PBS的10cm细菌培养皿中用镊子去除股骨及胫骨周围的肌肉碎片（有师姐说用刀片更好去除，可以试试）；

4.    用含1%双抗的PBS于10cm细菌皿内冲洗每块骨头十遍，重复3-5次，每次冲洗后用无菌镊子将骨头转移到另一干净皿内冲洗（每次转移后均要换镊子），操作迅速，注意无菌；

5.    在细菌皿中用左手拿持针器夹住骨头，右手拿剪刀剪去包括骺板在内的两侧干骺端，用10ml注射器（配1ml注射器针头）抽含1%双抗的DMEM冲洗骨髓腔，将骨髓冲入细菌皿中，冲洗髓腔至发白；

6.     将细胞悬液转移至15ml EP管中，1000rpm离心5min后收集细胞，可重悬后多离心几次以去除一部分杂细胞，在此期间可在T25中加入3ml含1%双抗，10%胎牛血清的α-MEM培养基；

7.     用1ml含1%双抗，10%胎牛血清的α-MEM培养基重悬EP管中的细胞沉淀，转入T25内，盖上盖后上下左右各晃动10次使细胞均匀分布；

8.    在体积分数为5%的CO₂和37℃条件下静置培养，2d后去除非贴壁细胞，以后每3～4d换液，

9.     待细胞长至70-80%时传代：吸去上清，用PBS洗2-3遍，注意不要吹到贴壁的细胞，用胰蛋白酶消化1min，待细胞在镜下成为圆形的漂浮细胞后加入1-2倍体积的含血清培养液终止消化，转移到15ml EP管中，1000rpm离心5min，弃上清后用培养液重悬，转移到新T25中，到3-4代时可加刺激或提PCR及蛋白。